乳糖诱导pET载体表达重组蛋白的研究

以重组人B淋巴细胞刺激因子（hBLyS）蛋白表达宿主菌株BL21（DE3）（pET30(a)/hBLyS）作为研究对象，借助SDS－PAGE分析方法，对于用乳糖诱导由T7lac启动子控制的重组目的产物的表达规律进行了优化研究。分析比较了诱导的起始阶段、所需的乳糖浓度和诱导持续时间等参数对重组产物表达的影响。实验结果表明，对T7lac启动子控制的重组目的产物，乳糖可以作为诱导剂；在对诱导条件进行优化控制的前提下，乳糖诱导目的产物的绝对表达量虽然不及IPTG，但相对成本却比IPTG低得多。研究结果为乳糖作为诱导剂应用于重组基因工程药物工业化生产提供了一定的参考。     

重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶蛋白在改良M9培养基中的诱导表达

以重组枯草芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶(L-谷氨酸:氨连接酶,Glutamine Synthetase, GS EC 6.3.1.2)蛋白表达宿主菌株BL21(DE3) (pET3C/谷氨酰胺合成酶)作为研究对象,借助SDS PAGE分析方法,对于用乳糖诱导由T7lac启动子控制的重组目的产物蛋白的各种基本参数进行了初步的研究.研究了最佳本底培养基、最佳碳源及其最佳添加比例、碳源与诱导物的最适组合,并探索了适用于改良型培养基的诱导参数.实验结果表明,对于重组目的产物蛋白,改良型M9培养基完全可以替代LB培养基;以甘油为碳源,可以避免葡萄糖对T7lac启动子的屏蔽作用.以乳糖为诱导物,目的蛋白的表达量、可溶性及酶活与以IPTG为诱导物基本接近.研究结果为酶法合成谷氨酰胺的工业化生产提供了一定的参考.     

φ10启动子控制下大肠杆菌中rhNTA表达的乳糖诱导

采用乳糖作为诱导物,对φ启动子控制下重组蛋白rhNTA（a new thrombolytic agent）在大肠杆菌中的表达进行研究,结果为培养12h（诱导6h）后湿菌体重量86．0－100．2g/L、目标蛋白占细胞总蛋白的40％－50％。研究了关键基质组分、乳糖诱导等对表达的作用。结果表明,基础料和补充氮源中酵母膏的比例、诱导时机和乳糖流加方式等对表达量的提高有明显的影响。实验显示,采用乳糖诱导时重组蛋白的可溶性部分占有较大的比例。     

乳糖诱导mIL-9蛋白高效表达研究

研究了乳糖诱导重组工程菌pET(32a+)-rmIL-9/BL21(DE3)高效表达rmIL-9融合蛋白的实验条件,探讨规模化生产rmIL-9的可行性.分别考察乳糖诱导时机、诱导浓度、诱导时间等参数对rmIL-9融合蛋白表达的影响,并通过正交实验,筛选最佳的乳糖诱导条件.结果显示,对于rmIL-9融合蛋白,乳糖作为诱导剂可达到良好的诱导效果,诱导产物的表达量可优于IPTG诱导产物.最优诱导表达条件为:当菌液OD600值为1时,添加终浓度为5g/L的乳糖,诱导9 h可以高效表达目的蛋白.实验表明,采用乳糖可以诱导rmIL-9融合蛋白基因的高效表达,此为动物实验评价rmIL-9治疗黑色素瘤提供了前期基础.     

乳糖诱导方式对降血糖药物表达的影响

对重组E.coli BL21(DE3)表达降血糖药物胰升血糖素样肽-1类似物的乳糖诱导方式进行了研究.结果表明诱导剂乳糖分批添加在生物量与蛋白表达量上均优于一次性添加方式,因为乳糖可被细菌作为碳源利用,分批添加乳糖诱导的目的蛋白表达量高达48.0%.研究结果证明乳糖分批流加可用于高密度发酵表达重组GLP-1类似物,并对其它重组基因工程药物的生产具有指导意义.     

诱导剂对重组人锰超氧化物歧化酶表达的影响

用异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）、乳糖、巯基乙醇对重组人锰超氧化物歧化酶（rhMn-SOD)工程菌进行诱导，结果表明3种物质都可以诱导rhMn-SOD外源蛋白的表述。通过酶活力、比活测定及电泳的结果显示，以乳糖作为诱导剂的表达效果明显好于IPTG和疏基乙醇，进一步的实验结果表明乳糖诱导的最佳浓度在80mmol/L。     

诱导条件对重组人锰超氧化物歧化酶发酵的影响

分别研究了3种诱导剂和Mn^2＋浓度对重组人锰超氧化物歧化酶（rhMn-SOD）发酵表达的影响,并进一步优化了乳糖诱导rhMn-SOD表达的条件。结果表明：异丙基--βD-硫代半乳糖苷（IPTG）和乳糖诱导能够获得类似的表达效果,诱导的同时加入2 mmol/L的Mn^2＋能够明显提高rhMn-SOD的表达。进一步的实验结果表明：乳糖诱导的最佳浓度为7 mmol/L,最佳时机为接种后6 h,A600为2.1,诱导表达6 h rhMn-SOD活性和比活达到最高。     

绿木霉ZY-01中纤维素酶EGⅣ基因的克隆及其在E.coli中的原核表达

以前期筛选到的纤维素酶高产菌株绿木霉T.viride ZY-01的总RNA为模板,利用RT-PCR技术克隆出内切葡聚糖酶EGⅣ基因,连接至pET-28a构建出重组质粒,并转化至E.coli BL21(DE3)中表达。该EGⅣ基因约有1089bp,在启动子T7lac的控制和IPTG的诱导下,目的基因成功地在原核细胞中表达。通过SDSPAGE检测得出目标蛋白分子量为39kDa,重组酶的比酶活为1.05U/mg,该酶最适pH值为6、最适反应温度为50℃。     

溶氧反馈-分批补料高密度培养枯草杆菌谷氨酰胺合成酶工程菌

为了建立枯草杆菌谷氨酰胺合成酶基因重组工程菌BL21/pET28b-glnA的高密度培养工艺,首先以摇瓶培养为基础,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如培养基、pH值、诱导剂浓度及时间等进行优化,再扩大至BIOTECH-SBG(5 L)自动玻璃发酵罐培养,利用溶氧反馈补料策略进行分批补料,并在培养过程中保持20%～50%的溶解氧,7.0～7.5的pH,以及1.0g/L乳糖诱导12 h,成功地进行了工程菌的高密度培养,最终细菌干重达到48.1 g/L,目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的55%,粗提物酶比活为10.35 U/mg,整个补料过程细菌比生长率稳定的控制在0.1 h-1左右.     

不同诱导方式对6-methylsalicylic acid在酿酒酵母（S．cerevisiae）中表达的影响

聚酮类化合物（Polyketids,PKS）是自然界广泛存在的由真菌或放线菌等微生物产生的,具有一系列复杂结构的微生物次生代谢产物,其中很多种类已经被开发成为具有抗菌、抗癌、抗肿瘤活性的药物．来源于Penicillium patulum中的6-MSAS（6-methylsalicylic acid synthase）是为数不多的几类从基闪水平到合成酶体系都已被完全阐明的真菌类PKS种类之一．本研究通过对摇瓶发酵的突变型菌株（S．cerevisiae334）在表达过程中诱导剂添加的时间和剂量对6-MSA合成的影响进行分析,结果表明：除24h和48h之间没有差异之外,在其他不同的诱导时间之间均为极显著差异．其中24h时加入诱导剂可以获得最高的6-MSA合成产量,为104．51mg·L^-1,在不同的诱导剂剂量的处理中,不同诱导剂剂量对最终产物的表达产量有极显著差异．其中添加w=10％的β-半乳糖诱导获得了最高的表达产量,为121．61mg·L^-1,不同的诱导方式在组合会对6-MSA的表达产生极其显著的差异．