利用人工控制细胞死亡策略培育抗稻瘟病水稻

利用细菌编码RNase的barnase 基因及其特异抑制剂编码基因barstar构成的双元组分系统, 把本实验室构建的具有稻瘟菌(Magnaporthe grisea)诱导活性的嵌合启动子与barnase基因融合, 再与由CaMV 35S启动子驱动的barstar的构件融合, 构建植物表达载体pWBNBS和pPBNBS, 转化水稻, 并对转基因水稻进行了抗稻瘟病和白叶枯病的检测. 结果表明, 接种稻瘟菌后, 转基因水稻植株中barnase基因受诱导表达; 在稻瘟菌侵染诱导下, barnase的表达超过barstar的抑制, 导致转基因水稻叶片出现类似过敏感应, 表现出对稻瘟病的抗性; 转基因水稻对白叶枯病表现出一定的抗性. 这些结果说明, 通过该双元组分系统策略获得的转基因水稻具有明显的抗致病性真菌和一定程度的抗细菌危害的较广谱抗性.     

水稻受稻瘟病菌诱导基因的分离和克隆

利用一对抗瘟性近等基因系(Near-isogenic lines, NILs)H7R(抗病)和H7S(感病),经稻瘟病菌小种早期诱导,提取RNA,进行mRNA差异显示(Differential display,DD)分析.在获得多个DD片段的基础上,经PCR重扩增、Sourthern杂交粗筛及Northern blotting进一步鉴定.阳性片段克隆于PGEM-T载体,经序列测定,国际联网查询,已获得两个受稻瘟病菌诱导的水稻新基因cDNA片段克隆. 在我国,Magnaporthe grisea是水稻稻瘟病的主要病害菌,由于生理小种的复杂性,抗病品种的抗性丧失已成为传统育种的一大难题.国际上对采用基因工程改良水稻的抗瘟性越来越重视并已成了各国竞争的热点.然而期望通过RFLP基因定位,并借助图谱克隆抗瘟性基因尚需多年的工作和大量的投入.此外,对于水稻与稻瘟病菌之间“基因对基因”的互作在分子水平上尚缺乏了解.本研究采用了本实验室完善的mRNA差异显示技术体系,在国际上首次用DD方法,鉴定和克隆受稻瘟病菌诱导的新的水稻抗瘟性和防卫反应候选基因.     

转基因马铃薯中病原诱导GO基因的表达及其对晚疫病的抗性

利用ＰＣＲ技术从黑曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中扩增并克隆了葡萄糖氧化酶（ｇｌｕｃｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ,简称ＧＯ）基因,并将马铃薯病原诱导型启动子（Ｐｒｐ１－１基因启动子）与其融合构建了植物表达载体ｐＣＡＭＧＯ。经农杆菌介导转化获得了转基因植株,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交显示葡萄糖氧化酶基因整合进马铃薯基因组。该基因的表达及所引起的Ｈ２Ｏ２的生成由淀粉－ＫＩ的显色反应得到证实。用马铃薯晚     

一个水稻P450 CYP72A基因簇受病原菌诱导和发育及组织特异性表达

细胞色素P450超基因家族广泛参与植物的各类生命活动,包括植物对病原菌的防卫反应.我们在植物病原菌诱导基因的DD-PCR分析时,分离到一个受病原菌侵染诱导的水稻cDNA片段.水稻基因组公布后,发现该片段位于1个包含7个P450 CYP72A基因(CYP72A17～23)的基因簇的保守部分.以此片段搜索水稻数据库发现,水稻CYP72A家族有14个成员,这14个蛋白质之间的差异主要在N端,C端则同源性很高.我们分别对该基因簇的7个成员进行了表达特性分析,发现其中CYP72A18,19,22和23的表达受稻瘟病菌侵染的调节,而且在抗、感植株中的表达存在明显差异.除CYP72A20外,其余6个CYP72A基因均具有发育和组织特异性表达的特征.CYP72A20在所有研究中均检测不到信号,可能为一个假基因.这些发现为水稻P450基因功能的研究提供了新的资料.     

一个水稻P450 CYP72A基因簇受病原菌诱导和发育及组织特异性表达

细胞色素P450超基因家族广泛参与植物的各类生命活动, 包括植物对病原菌的防卫反应. 我们在植物病原菌诱导基因的DD-PCR分析时, 分离到一个受病原菌侵染诱导的水稻cDNA片段. 水稻基因组公布后, 发现该片段位于1个包含7个P450 CYP72A基因(CYP72A17~23)的基因簇的保守部分. 以此片段搜索水稻数据库发现, 水稻CYP72A家族有14个成员, 这14个蛋白质之间的差异主要在N端, C端则同源性很高. 我们分别对该基因簇的7个成员进行了表达特性分析, 发现其中CYP72A18, 19, 22和23的表达受稻瘟病菌侵染的调节, 而且在抗、感植株中的表达存在明显差异. 除CYP72A20外, 其余6个CYP72A基因均具有发育和组织特异性表达的特征. CYP72A20在所有研究中均检测不到信号, 可能为一个假基因. 这些发现为水稻P450基因功能的研究提供了新的资料.     

短小芽孢杆菌启动子活性片段的克隆、表达及序列特征分析

利用启动子探测载体克隆在组织培养水稻表面定殖外附生的短小芽孢杆菌的启动子活性片段。对克隆到的启动子片段进行了序列测定,证明均为新的DNA序列。通过测定CAT酶活性、对启动CAT基因转录的强度进行了分析,得到了6个较强的启动子元件。用RNA引物延伸法对启动子序列的转录起始点进行了定位,并对启动子的结构进行了初步分析,发现有3个启动子与枯草杆菌σ^29型启动子结构相似,其余两个为未知的启动子。     

拟南芥profilin2启动子5′端缺失对维管束特异表达的影响

用PCR法扩增并克隆了profilin2全长启动子（1667bp）,经5′端不同长度缺失,与gus（uidA）基因连接,构建植物表达载体,转化伽蓝菜,证实在转基因植株中全长启动子Pfn1．7,呈维管束特异表达,5′端缺失分析显示,可将该启动子分为3个区段：区段1,－1167－1380bp,缺失该区段为gus基因由维管束特异表达变为组成型表达,推测在该区段中存在维管束特异表达元件;区段2,－1153－－597bp,强烈抑制gus基因的表达;区段3,-597－－1bp,可认为是profilin2的基本启动子。     

Rb1基因启动子和增强子的鉴定

视网膜母细胞瘤易感基因(retinoblastoma susceptibility gene)为癌变过程中的重要肿瘤抑制基因.该基因参与调控体内多个生理过程,主要包括细胞周期、细胞凋亡以及细胞分化等进程.Rb1主要通过与E2F1/DP1复合物的相互作用调控细胞周期运转和细胞凋亡过程.早期小鼠遗传学研究表明,Rb1基因缺...     

大豆早期结瘤素基因enod2B启动子在水稻中的表达受结瘤因子诱导

在根瘤菌与宿主豆科植物形成的共生关系中, 根瘤菌分泌的结瘤因子是宿主专一性的主要决定因子. 结瘤因子信号能够诱导豆科植物根毛细胞质膜去极化、离子流动和早期结瘤素基因的表达以及根毛变形、皮层细胞分裂和根瘤原基形成等与共生有关的表型变化. 水稻是重要的粮食作物, 能否对结瘤因子信号产生应答反应是最终实现水稻结瘤固氮的关键因素. 将大豆早期结瘤素基因Gmenod2B的启动子与报告基因b-葡萄糖苷酶(GUS)基因融合构建成嵌合基因Gmenod2BP-GUS, 以此嵌合基因作为探索水稻细胞感受结瘤因子信号的分子标记. 通过根癌农杆菌介导的遗传转化系统, 获得了携带嵌合基因Gmenod2BP-GUS的水稻再生植株. 以广宿主根瘤菌NGR234(pA28)分泌的结瘤因子作为探针, 检测转基因水稻中嵌合基因Gmenod2BP-GUS的表达. 结果表明, 转基因水稻中大豆早期结瘤素基因enod2B启动子的表达可以受结瘤因子诱导, 仅在水稻根部的皮层薄壁细胞和内皮层细胞中呈特异性表达, 并且受到氮源的调控. 推测在水稻中可能存在结瘤因子所诱导的豆科早期结瘤素表达的类似机制.     

虫害诱导的水稻挥发物抑制水稻病原菌的生长

虫害诱导的植物挥发物在调节植物、植食性昆虫及其天敌的相互关系以及植物与植物之间的化学通讯中有重要作用. 为了阐明植物挥发物功能的多样性, 研究了虫害诱导的水稻挥发物对植物病原菌生长的影响. 结果表明, 供试的7种虫害诱导的水稻挥发物对稻瘟病菌Pyricularia grisea Sacc. 和水稻纹枯病菌Rhizoctonia solani Kuhn. 的生长均有抑制作用. 挥发物的种类以及不同的处理浓度导致了抑制作用间的差异, 其中绿叶性气味物质(E)-2-己烯醛和(E)-2-己烯-1-醇对病原菌抑制作用最强, 另外萜烯类物质中芳樟醇对其也有明显的抑制. 虫害诱导的挥发物对植物病原菌生长的抑制说明了植物间接防御物质具有对植物病原菌直接防御的功能, 植物挥发物在植物病虫害防治中的潜力巨大.     

3种化学诱导物对大鼠GST-P基因表达的影响及机理

大鼠谷胱甘肽Ｓ－转移酶Ｐ基因可被多种化学致癌物诱导表达,采用基因诱导实验,共转染报告质粒瞬时表达实验,凝胶阻滞实验和分子杂交实验探讨了３种化学物诱导ＧＳＴ－Ｐ基因表达的机理。     

水稻抗病基因同源序列的克隆、定位及其表达

根据已知植物抗病基因的保守区域设计引物,从抗稻瘟病水稻品种种窄叶青８号第１链ｃＤＮＡ和基因组ＤＮＡ中扩增出３个与植物抗病基因同源的序列：Ｏｓｒ１,Ｏｓｒ２和Ｏｓｒ３,三者核苷酸水平的同源性在９８％以上。     

稻瘟病菌坏死和乙烯诱导肽1样蛋白的原核表达、纯化与活性分析

坏死和乙烯诱导肽1(necrosis and ethylene-inducing peptide 1, Nep1)样蛋白(Nep1-like proteins, NLPs)是一类广泛存在于细菌、真菌及卵菌中的分泌型蛋白.本研究通过生物信息学分析了稻瘟病菌中的4个坏死和乙烯诱导肽1样蛋白的家族基因成员的相关信息,克隆了它们的编码区序列,分别将它们构建到了pGEX-6P-1载体中.通过优化诱导条件对它们进行了原核表达、纯化,获得了相应的可溶性目的蛋白,进一步将纯化的目的蛋白注射到烟草叶片中,发现N端融合GST标签的MoNLP1、MoNLP4蛋白仍具有生物学活性,可以明显诱发烟草叶片组织产生细胞坏死.该研究为进一步深入研究该基因家族在稻瘟病菌中的功能与作用以及开发更多潜在的植物蛋白激发子奠定基础.     

C3—C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶P—蛋白亚基上游调控序列在转基因水稻中的表达

将C3-C4中间型植物Flaveria anomala中甘氨酸脱羧酶(GDC)P-蛋白亚基基因(gdcsP)的上游调控序列与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因编码区以及CaMV终止子融合,构建植物表达载体.采用农杆菌介导方法转化水稻,并在转基因水稻中分析了GUS的表达活性和特异性.结果表明,在水稻中gus嵌合基因特异地在木质部和韧皮部表达,在不同器官及组织中表达活性也有所差异,其中以根中最高,茎秆次之,叶再次,而在成熟胚乳中没有表达.在转基因水稻中,gdcsP启动子的表达也受水稻发育时期的调控,随植物组织成熟度的增加而降低.     

卵黄蛋白原启动子驱动的防御素基因在转基因按蚊中的高效可调控性表达

遗传修饰蚊虫, 使其不传播疾病或使蚊虫种群密度下降, 是一种控制蚊媒传染病的新策略. 该策略实施的前提是能够改造蚊虫的基因组, 使得效应分子在适宜启动子驱动下, 在转基因蚊中高效特异表达. 本研究旨在评价冈比亚按蚊卵黄蛋白原启动子驱动的中华按蚊防御素基因在转基因斯氏按蚊中的表达效果. 克隆冈比亚按蚊卵黄蛋白原启动子序列, 并将其与已克隆的中华按蚊防御素基因顺式插入穿梭载体pSLFa, 然后再插入转化载体pBac[3xP3-DsRedafm]的AscⅠ位点; 将重组质粒pBac[3xP3DsRed-AgVgT2-DefA]和帮助质粒phsp-pBac DNA显微注射入斯氏按蚊的虫卵. 通过观察G1代幼虫眼部的特异荧光筛选出两株转基因阳性品系; Southern blot证明, 防御素基因的表达元件以单拷贝的形式插入到蚊基因组中; RT-PCR分析显示, 防御素基因在吸血后雌蚊的脂肪体中得到了特异高效表达, 而且防御素的表达比较内源性卵黄蛋白原能维持较长的时间, 因此多次吸血后的防御素表达呈现出可调性非周期型, 这对其发挥抗病原作用非常重要. 结果表明, 按蚊属蚊虫的卵黄蛋白原启动子和防御素基因在不同种按蚊中功能保守, 可以作为转基因抗疟研究中的候选调控分子和功能分子.     

基因组中双重位点特异性重组体系的建立及应用

应用重组ＤＮＡ技术,将ＦＲＴ－ＦＲＴ和ＬｏｘＰ－ＬｏｘＰ两套重组酶特异的识别位点构建在一个名为Ｃ４ＬＦＹ的载体中,并依次在载体中构建了Ｐ因子、果蝇ｙｅｌｌｏｗ基因的两个外显子和一个内含子、顺式作用元件（启动子和增强子）和侧翼区ＤＮＡ,组成了双重位点特异性重组体系。通过转基因技术将该体系整合到果蝇基因组中,再分别与特异的ＦＬＰ和Ｃｒｅ重组酶相互作用后,成功地在基因组同一位点上完成了ＦＬＰ／ＦＲＴ和Ｃ     

果实专一性启动子驱动ipt基因在番茄中的表达及其对番茄果实发育的影响

用PCR方法获得了番茄果实性启动子（2A12）和农杆菌（C58）Ti质粒上的ipt基因。分别构建由2A12驱动下的gus和ipt基因的植物表达载体，并使中嵌合基因经农杆菌介导转入番茄品种“中蔬4号”的基因组中，GUS组织化学活性分析表明，2A12启动子具有严格的果实表达专一性。2A12驱动ipt基因在番茄中表达，使得果实中细胞分裂素的含量增加，最终导致果实中种子发育的停滞和胎座组织的增厚，并形成无籽番茄果实，同时转基因番茄果实成熟进程受阻且果实采用的储藏保鲜时间延长了1－2周，进一步分析发现，转基因番茄坐果率和产量均有不同程度的增加，虽然可溶性糖含量略有降低，但果实中干物质和粗蛋白含量有所增高。     

苜蓿根瘤菌nodD3P1启动子下游序列的调节功能

苜蓿根瘤菌结瘤正调节基因ｎｏｄＤ３的Ｐ１启动子到编码区间有一长６６０ｂｐ的序列,称为Ｐ１下游序列,内含有两个潜在的开发放阅读框,即ＯＲＦ１和ＯＲＦ２,其中ＯＲＦ２可编码一个含８６个氨基酸残基的多肽。     

纯合子人βE-珠蛋白基因转基因鼠系的建立

血红蛋白E(Hb E)是我国常见的异常血红蛋白病,它是由β-珠蛋白基因第26位编码子的G→A点突变引起.因Hb E与β-地中海贫血症状相似,又称之为地中海贫血样综合征;它也常与β-地中海贫血复合存在,危害严重.利用转基因动物技术研究真核基因表达调控已取得重要进展.已发现β-珠蛋白基因簇和α-珠蛋白基因簇上游区的DNase Ⅰ敏感区能明显提高珠蛋白基因的表达水平.其中β-基因簇的HS-2和α-基因簇的HS-40具有典型的增强子作用.     

大豆疫霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因在病原物植物互作中诱导表达及其抗氧化作用在酵母遗传互补系统中的功能验证

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)是真核生物细胞中一类功能丰富的蛋白质. 采用抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)的方法, 筛选到一个在大豆疫霉侵染早期上调表达的、编码GAPDH的cDNA片段; 克隆了该基因的全长序列, 命名为PsGapdh. Southern杂交结果显示, PsGapdh在大豆疫霉基因组中含有3个拷贝. 该基因编码的氨基酸序列具有GAPDH的保守结构域. 在系统发育树中, PsGAPDH与两性绵霉(Achlya bisexualis)的GapC1同源性最高、与中华盒形藻(Odontella sinensis)和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的GapC2同源性较高, 三者聚类分布于GapC亚族的C-Ⅱ分支. RT-PCR分析表明, 该基因在大豆疫霉侵染早期转录水平提高. 该基因可以恢复酵母突变体Δtdh1对H₂O₂的耐受性. 上述结果提示, 大豆疫霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶具有与酵母tdh1相似的抗氧化作用, 且参与了大豆疫霉对寄主植物的侵染过程.