基于CRISPR/Cas9技术建立敲除Plac9基因的人胚肾细胞株

目的:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和流式细胞术相结合,获得可编辑Plac9基因敲除的人胚肾细胞株(293T).方法:根据Plac9外显子设计了4个sgRNAs(S1,S2,S3,S4),分别将其与PX458载体连接,构建了PX458-S1(S2/S3/S4)载体.通过转染试剂lipo2000将表达载体分别转染至293T细胞中,并以流式细胞术对带绿色荧光蛋白标记的细胞进行单细胞分选,分选后的细胞培养一段时间后,用基因组测序和错配酶酶切进行筛选.从筛选好的细胞中提取蛋白,进行Western Blot检测敲除效率.结果:采用CRISPR/Cas9和流式细胞术结合技术成功构建了Plac9蛋白表达缺失的人胚肾细胞株.结论:该方法简便快捷、效率高,可广泛地用于编辑各种细胞和细胞功能研究.     

基于 CRISPR / Cas9 技术构建点突变小鼠概述

摘要:2013 年 CRISPR( Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) / Cas( CRISPR-associated) 系统证实能够对人的细胞和其他真核细胞进行基因组编辑,现已广泛应用于生物医学领域。 本文对 CRISPR 在点突变小鼠构建中的应 用 进 行 概 述,为 单 向 导 RNA ( single guide RNA, sgRNA) 和 修 复 模 板 单 链 寡 聚 核 苷 酸 ( single-strand oligonucleotide,ssODN)的设计及体外转录、受精卵显微注射、子代鼠的鉴定等提供理论参考。     

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶、珍妮弗·杜德纳:因CRISPR/Cas9基因剪刀而获2020年诺贝尔化学奖的两位女科学家

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶和珍妮弗·杜德纳,因合作开发基因编辑技术——CRISPR/Cas9基因剪刀而获得2020年诺贝尔化学奖.CRISPR/Cas9技术的低成本、强易用性和高效率,促进了生命科学的突破性发展,也使它拥有了巨大的商业价值.通过回顾两位科学家的科研历程和基因编辑领域的成就,提出了相关的思考和启示.     

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶、珍妮弗·杜德纳:因CRISPR/Cas9基因剪刀而获2020年诺贝尔化学奖的两位女科学家

埃马纽埃尔·卡彭蒂耶和珍妮弗·杜德纳,因合作开发基因编辑技术——CRISPR/Cas9基因剪刀而获得2020年诺贝尔化学奖.CRISPR/Cas9技术的低成本、强易用性和高效率,促进了生命科学的突破性发展,也使它拥有了巨大的商业价值.通过回顾两位科学家的科研历程和基因编辑领域的成就,提出了相关的思考和启示.     

基因治疗中目的基因的导入方法

基因治疗正从实验室研究走向临床应用，它给医学界引入了一种全新的概念，基因治疗主要是利用病毒介导的基因转移。文中介绍了目前已应用和将要应用于人类基因治疗的逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体等的构建方法，优缺点和适于治疗的疾病。扼要地介绍了目的基因导入的理化方法。     

利用改良的CRISPR/Cas9系统构建猪PPARD 载体及效率检测

为了构建猪PPARD基因编辑载体并进行基因编辑效率检测,本研究利用改良的双位点编辑CRISPR/Cas9载体系统,根据PPARD基因结构和序列特点,设计2个能靶向切割PPARD基因的sgRNA序列,将2个PPARD sgRNA表达盒以串联的形式连接到一个CRISPR/Cas9载体中。将构建的质粒转染PK15细胞,提取各组细胞DNA,PCR扩增突变区域后,通过序列测定在DNA水平检测载体编辑效率。分别提取各组细胞总RNA及细胞总蛋白,利用qRT-PCR及Western blot在基因表达及蛋白表达水平上检测重组载体的基因编辑效率。结果发现,PPARD-2KO组DNA总突变率为45.83%(22/48);与正常对照组相比,PPARD基因编辑组中PPARD mRNA显著下降84%(P<0.01),PPARD蛋白表达量显著下降61%(P<0.01)。本研究利用改良的CRISPR/Cas9载体系统成功构建了高效PPARD基因编辑载体,并且未经药物筛选即可在细胞上实现高效率基因编辑,将大幅提高后续筛选单细胞克隆效率,推进对PPARD基因的功能研究。     

原核CRISPR-Cas系统的结构功能及应用

CRISPR-Cas系统是新近在原核生物中发现的一种抵御外来DNA入侵的免疫机制,由一个成簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和附属的蛋白质(Cas)组成,广泛分布于真细菌和古菌中.CRISPR由重复序列及其间隔序列组成,间隔序列来自于过去的入侵DNA,并插入到细菌的CRISPR排列中.一旦出现新的入侵,CRISPR转录,其RNA经过加工后与Cas蛋白质组成一个核蛋白复合体,该复合体通过RNA与入侵DNA序列之间的互补配对,结合目标序列,最后Cas蛋白质将入侵DNA降解.此外,基于CRISPR系统中的Cas9蛋白,发展了一种新的基因组编辑技术,在不同的细胞中均能获得高效的基因定点打靶,展现出巨大的潜力.     

基因编辑综合实验设计与实践

基于本科生科研创新能力的培养需求,该文设计了"利用CRISPR/Cas9技术对哺乳动物细胞进行基因编辑"这一探究性综合实验,将原创性前沿科学研究引入到学生的实验教学中.通过该实验课程的学习,学生能够掌握一定的生物信息学知识以及分子生物学、生物化学和细胞生物学相关的常规科研方法和手段.实践表明,通过相对完整的科研探索,该...     

靶向小鼠CREPT基因CRISPR/Cas9敲除质粒的构建

目的 利用规律间隔成簇短回文重复序列/相关蛋白9(CRISPR/Cas9)系统构建靶向小鼠CREPT基因的敲除质粒。方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计原则靶向小鼠CREPT基因的sgRNAs,与体外转录载体pUC57-sgRNA连接,构建CREPT基因敲除质粒;体外切割实验验证设计的sgRNAs是否具有活性。结果 设计了3条sgRNAs并分别准确插入pUC57-sgRNA载体;体外切割实验结果显示,以上3条sgRNAs均能够介导Cas9蛋白对靶片断进行切割。结论 制备了小鼠CREPT基因敲除质粒和体外转录的sgRNAs,为构建CREPT基因敲除小鼠模型奠定了重要基础。     

CRISPR/Cas9核糖核蛋白介导的无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变

【目的】CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术,具有简单、精准等特点,已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中。目前,通过微粒轰击技术将Cas9蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞,获得无选择标记的基因编辑植物,该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路。【方法】本研究以白桦(Betula platyphylla×B.pendula)BpGLK1基因为编辑的靶基因,采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK1基因编辑。在白桦BpGLK1基因的第1外显子处设计靶位点,采用PCR扩增技术获得BpGLK1-E1靶位点片段;采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK1-E1重组质粒,将该质粒线性化后与Cas9蛋白作用,体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性。以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体,采用微粒轰击技术进行BpGLK1定向诱变。【结果】CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示：Cas9蛋白及gRNA复合体具有裂解活性,可在BpGLK1靶位点的特定位点进行有效切割。以白桦成熟胚为材料,在无光照条件...     

Cationic polymeric nanoformulation: Recent advances in material design for CRISPR/Cas9 gene therapy

CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat/clustered regularly interspaced short palindromic repeat associated proteins 9) gene editing platform is a promising therapeutic tool for genetic disorders, due to its ability to manipulate the pathogenic gene in genomic level and to easily target specific gene by manipulating single-guide RNA. However, its successful delivery remains a challenge. Up to now, great efforts have been made to explore an effective strategy for CRISPR/Cas9 delivery. But among those delivery methods, physical methods are mainly operated on cultured cells thus limited to laboratorial use; viral vectors are hindered by fetal immunogenic and carcinogenic effects thus dubious in clinical application. Therefore, cationic polymeric vectors, with the ability to interact with CRISPR/Cas9 system to form a nanoformulation as a non-viral approach, are attracting increasing attentions, due to advantages such as well protection of cargos, less limitation in payload size, low immunogenicity or carcinogenicity, potential modifications for further functions, and ease in mass production. In this review, the recent discoveries on polymeric vectors utilized in delivery of CRISPR/Cas9 system will be summarized. With emphasis on advanced features of those polymeric vectors or their nanoformulations to meet the demands of different CRISPR/Cas9 delivery forms (plasmid, mRNA or protein), the detailed illustrations on their disease treatment applications, such as cancer, diabetes or antibiotic-resistant infections, will also be reviewed.     

一种新型的构建CRISPR/Cas9 KnockOut载体的方法

利用CRISPR/Cas9系统这一基于细菌核酸酶Cas9的新型基因编辑工具,可以在原核细胞和真核细胞中实现基因敲除的功能.首先使用CRISPR设计工具设计靶点,退火来制备sgRNA双链,用Bsm BⅠ酶切割gRNA质粒,构建Lenti CRISPRv2的重组质粒.通过U6启动子上的LKO1.5引物对每个菌落序列进行了测序验证,结果表明利用此新方法可以成功构建CRISPR/Cas9系统的Knock Out载体.     

基因编辑技术在花卉育种中应用的研究进展

相较传统育种,基因编辑育种能够更精准、高效地改变植物的性状,获得优良的品种.目前应用基因编辑技术于花卉育种研究的报道相对较少.该文综述了基因编辑技术,特别是规律成簇的间隔短回文重复/CRISPR-关联核酸内切酶9(CRISPR/Cas 9)在花卉中的研究进展及其局限性,同时还就花卉基因编辑育种的发展方向进行了讨论,希望...     

CRISPR/Cas技术在木本植物改良中的应用

木本植物育种周期长、种质资源匮乏,已成为限制木本植物种质创新的主要因素。CRISPR/Cas系统是近年来发展起来的能够实现对基因组进行精准定点编辑的技术,具有操作简单、周期短、效率高等优点,可实现基因的敲除、插入、替换等目的,从而精确地引入目标性状。目前,该技术已在多种家畜、昆虫、作物中得到了成功应用,对大量性状进行了改良,实现了种质资源的原始创新,大大缩短了育种年限。CRISPR/Cas技术的产生为木本植物的遗传改良提供了契机。笔者对CRISPR/Cas技术在杨树(Populus spp.)、苹果(Malus spp.)、柑橘(Citrus spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、木薯(Cassava spp.)等木本植物育种中的应用进行了总结,该技术实现了T0代木本植物优良基因型的固定,在生长、材性、抗病性、抗旱性等性状上得到了明显改善,加快了木本植物育种进程,提高了育种效率。但该技术在木本植物中的应用尚处于起步阶段,还存在脱靶率高、编辑效率低、纯合突变少等问题。基于此,对CRISPR/Cas技术在木本植物中的应用前景进行了展望,以期为木本植物基因功能研究及品种改良提供有益参考。     

基于CRISPR/Cas9的毛果杨bHLH106转录因子的功能研究

目的 采用CRISPR/Cas9基因编辑系统创制毛果杨(Populus trichocarpa)bHLH106(Basic Helix-Loop-Helix 106)基因的突变体,分析植株的表型特征,初步揭示PtrbHLH106基因在毛果杨木材形成过程中的功能。方法 基于前期对毛果杨野生型(WT)茎干的不同细胞类型(形成层、木质部和韧皮部细胞)RNA-seq数据,克隆得到一个在形成层及木质部较高表达的bHLH基因PtrbHLH106。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术创制毛果杨PtrbHLH106的功能缺失突变体。对生长60、90、120 d的毛果杨ptrbhlh106突变体和WT植株进行表型观察;对生长120 d的植株各茎节进行石蜡切片,利用甲苯胺蓝染色观察并进行细胞统计分析。结果 获得毛果杨ptrbhlh106突变体;与WT相比,突变体植株的株高、地径无明显差异;在整个测量的生长周期中,第8茎节长度有缩短的趋势,茎节数量有增加的趋势;形成层细胞层数有增加的趋势但差异不显著,导管细胞孔径显著增大,纤维细胞数量显著减少。结论 ptrbhlh106突变体与WT植株在导管孔径和纤维细胞数量上存在差异,初步证明PtrbHLH106基因参与了调控毛果杨次生木质部的发育。     

转录因子Bach1在心血管疾病中的研究进展

转录因子Bach1(BTB-CNC同源体1, BTB and CNC homology 1)是一种转录抑制因子, 广泛存在于哺乳动物的各种组织中. Bach1能抑制血红素环氧化酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)等抗氧化基因的表达, 参与氧化应激反应. Bach1基因敲除对心肌缺血再灌注损伤有保护作用. 近期研究发现Bach1能抑制Wnt/b-catenin信号通路和小鼠缺血下肢血管新生. 主要就Bach1在心血管疾病中的研究进展进行简要综述.     

高效切割Hipp11 敲入位点的sgRNA 设计及活性验证

摘要: 目的设计并验证能够高效切割Hipp11 位点的sgRNA,为在Hipp11 位点定点敲入外源基因提供工作基础。方法使用预测软件对Hipp11 位点的sgRNA 进行预测并挑选脱靶效应较低的两个sgRNA。构建相应载体,通过CRISPR/Cas9 活性检测试剂盒在体外检测sgRNA 的活性。选取活性较高的sgRNA 体外转录,与Cas9 mRNA 一并注射受精卵。检测出生后小鼠Hipp11 位点切割效率,计算出sgRNA 的体内活性。结果两个sgRNA 的体外活性分别为19. 2%和51. 7%,使用体外活性高的2 号sgRNA 显微注射获得8 只新生小鼠,其中62. 5% ( 5 /8) 的小鼠中检测到Hipp11 位点周围发生碱基插入或缺失。结论获得一个能够引导高效切割的Hipp11 位点通用型sgRNA,从而为基因CRISPR 技术在Hipp11 位点定点插入外源基因奠定基础。sgRNA 体外活性能够预测sgRNA 在体内的切割活性,表明体外活性验证是筛选高活性sgRNA 的有效手段。     

单基因遗传疾病的基因疗法

基因疗法是全球突破性技术之一,在单基因遗传疾病治疗中已取得突破性进展。阐述了不同的基因疗法策略、载体和基因编辑技术的特点,综述了脊髓性肌萎缩症、Leber先天性黑蒙2型、血友病、β-地中海贫血的发病机理、临床表现、基因疗法的开发进程以及临床试验情况。目前,上述4种单基因疾病的9种基因疗法已分别取得美国食品药品监督管理局突破性疗法资格、欧洲药品管理局的优先药物资格或者已经批准上市。基因疗法的研究还面临着许多挑战,但随着科学研究的深入和科学技术的不断发展,将有更多的患者获得治疗。