斜带石斑鱼ERP44基因的克隆与表达分析

为进一步了解内质网蛋白44基因(ERP44)在石斑鱼免疫反应中的作用,本研究根据实验室石斑鱼转录组数据中ERP44的表达序列标签(EST)设计引物,克隆了斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)Ec-ERP44基因的开放阅读框序列(ORF),利用生物信息学手段分析Ec-ERP44基因及其编码蛋白的序列结构和特征,并通过实时荧光定量PCR检测该基因的组织分布特征,以及脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)、聚肌胞苷酸(Polyinosinic-polycytidylic acid, Poly I:C)刺激后该基因在石斑鱼脾脏中的表达变化。研究结果表明,Ec-ERP44基因ORF全长1 233 bp,编码410个氨基酸;该蛋白具有蛋白质二硫键异构酶(PDI)家族保守的硫氧还蛋白结构域。同时,Ec-ERP44基因在健康石斑鱼体内的多种组织均有表达,其中在脑组织中的表达量最高;在LPS与Poly I:C刺激后,石斑鱼脾脏中Ec-ERP44基因的表达显著上调。本研究结果表明,Ec-ERP44基因参与了石斑鱼抗病原感染的免疫反应。     

石斑鱼卵巢cDNA文库构建及脂肪酸结合蛋白克隆

应用SMARPTM技术构建了斜带石斑鱼Epinephelus coioides卵巢cDNA文库。所构建的cDNA文库滴度为4.5×106 pfu/mL,重组率为99％,扩增后文库的滴度为1.2×1010pfu/mL。把phagemid转化为质粒后,随机挑选60个阳性克隆进行酶切鉴定和测序。酶切结果表明:插入片段长度均在500~3 000 bp之间。测序结果经过生物信息学分析,发现其中一个克隆为脂肪酸结合蛋白(FABP)基因全长,并与人肝型(L)脂肪酸结合蛋白同源性最高,为70％。     

斜带石斑鱼白细胞介素8基因的克隆与表达分析

为了研究斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)白细胞介素8(IL-8)的结构和功能,本实验对其基因序列进行了克隆和分析. 运用RACE-PCR方法,从斜带石斑鱼总RNA反转录cDNA库中获得了961 bp 长的cDNA全序列. 同时利用RT-PCR 技术,检测了微壁溶球菌诱导前后该基因在斜带石斑鱼体内不同组织之间的表达差异. 结果表明,斜带石斑鱼IL-8cDNA序列包含235 bp 的5′非编码区,438 bp的3′端非编码区和288 bp 的开放阅读框,编码95个氨基酸. 未诱导前,斜带石斑鱼IL-8基因主要在心、头肾、脾和肝脏中表达,在鳃和肠中量表达,在胃、肌和皮中几乎没有表达;诱导后,IL-8基因强烈表达于所有取样器官. 所获得的斜带石斑鱼IL-8基因是一种与炎症作用有关的CXC亚族趋化性因子.     

斜带石斑鱼染色体核型分析

采用PHA、秋水仙碱腹腔注射，肾细胞直接制片法分析了斜带石斑鱼染色体核型。结果表明，斜带石斑鱼核型为：2n=48=2sm 46t,臂数：NF=50．     

斜带石斑鱼肝脂酶和脂蛋白脂酶基因克隆与序列分析

为从分子水平研究海水鱼类肝脂酶(hepatic lipase,HL)和脂蛋白脂酶(liportein lipase,LPL)基因在脂质代谢过程中的作用及其分子系统进化地位,采用RT-PCR及RACE法从斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)肝脏克隆得到HL、LPL基因cDNA全序列.克隆获得斜带石斑鱼肝脏HL基因cDNA全长2 261 bp,其中5′非翻译区(5′-UTR)为186 bp,3′-UTR为590 bp,开放阅读框(ORF)为1 485 bp,编码494个氨基酸;LPL基因cDNA全长2 191 bp,其中5′-UTR为 144 bp,3′-UTR为 499 bp,ORF为1 548 bp,编码515个氨基酸.序列同源性分析表明,斜带石斑鱼HL、LPL基因与哺乳动物同源性均低于真骨鱼类罗非鱼、斑鳢和真鲷等,这与其亲缘远近关系相一致,表明HL、LPL在进化过程中都相对保守.构建系统发生树显示,斜带石斑鱼HL、LPL基因氨基酸序列与大口黑鲈、真鲷等共同占据进化树上独立的分枝,与较为原始的硬骨鱼类中华鲟在进化树上距离较远.本实验对斜带石斑鱼HL、LPL基因同源性、系统进化地位的研究,为进一步研究海水鱼类脂代谢调控机制,预防鱼类脂代谢疾病奠定了基础.     

赤点石斑鱼♂与斜带石斑鱼♀杂交的初步研究

叙述了4批赤点石斑鱼♂与斜带石斑鱼♀杂交的初步结果。用人工授精的方法可以取得杂交受精卵,受精卵的受精率、孵化率和仔鱼的畸形率与雌鱼的卵质有关;杂交组与对照组的斜带石斑鱼相比,受精率、孵化率和畸形率无显著差异,但发育速度较快;杂交组仔鱼与对照组仔鱼在孵化后11 d内的生长速度差异不显著,但12 d后杂交组仔鱼增长显著;杂交组仔鱼的不投饵活力系数SAI和育苗成活率较对照组显著高,初步表现出杂交的优势。     

斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白的原核表达与纯化

将含有斜带石斑鱼Epinephelus coioides神经坏死病毒(orange-spotted grouper nervous necrosis virus,OGNNV)主衣壳蛋白(major capsid protein, MCP)基因的重组表达质粒载体pET32a-MCP转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行融合表达,经SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定,证实了重组大肠杆菌融合表达了斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白.表达的融合蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在,提取的包涵体中融合蛋白含量占60%以上,经柱层析纯化蛋白,纯化度达90%以上.     

斜带石斑鱼、赤点石斑鱼RAPD和线粒体Cyt b基因序列变异分析

斜带石斑鱼和赤点石斑鱼为具有重要经济价值的海水鱼类。对这两种石斑鱼进行了随机扩增多态DNA(RAPD)和线粒体细胞色素b(Cyt b)基因序列变异分析。计算多态位点百分率、基因多样性和香农信息指数等遗传参数,以此评估种内遗传变异水平;通过统计变异位点、平均核苷酸差异数、核苷酸多样性以及种间平均每位点核苷酸替代数进行基因序列变异分析,并构建UPGMA系统树。结果表明:斜带石斑鱼的遗传多样性水平高于赤点石斑鱼,这可能与它们在种内特定遗传结构、分布范围大小、自然资源状况的差异有关;斜带石斑鱼和赤点石斑鱼之间检测到的种特异RAPD条带以及基因序列的变异,可作为种间分子鉴定标记。     

甲状腺素和生长激素与斜带石斑鱼早期个体发育的关系

采用放射免疫法测定了斜带石斑鱼卵、胚胎及仔鱼组织的三碘甲腺原氨酸(T3)水平。斜带石斑鱼未受精卵中含有较高的T3水平，达每克体质量2，75ng，于开口期升至每克体质量6.28ng，之后保持在较低水平。用T3浸泡处理4～5周仔鱼，当T3浓度达到10^-8mol／L以上时，外源T3才能引起组织T3水平增加；10^-8mol/L的作用比10^-7mol/L的作用弱，浸泡24h所引起的T3增加幅度明显高于72h；对4周仔鱼的影响明显强于5周仔鱼。这些结果证实了斜带石斑鱼卵中存在母源T3，其自身内分泌腺的分化可能始于孵化期或开口期，处于变态后期的仔鱼已具有一定的调节组织甲状腺素水平的能力。外源T3能影响4--5周仔鱼组织L水平的最低浓度为10^-8mol／L,浸泡2，4h对发育早期的仔鱼作用较强。用RT-PCR检测了斜带石斑鱼卵、胚胎及仔鱼生长激素(growth hormone，GH)mRNA的表达情况，表明未受精卵中有较高水平的GH mRNA表达，受精卵至囊胚期胚胎的GH mRNA表达水平较低，原肠期以后，胚胎GH mRNA的表达量明显增加，进一步证明硬骨鱼从受精卵开始就存在GH mRNA的表达，并在自身内分泌腺分化之前参与鱼类早期发育的调节。总之，斜带石斑鱼的早期发育受甲状腺素和生长激素的共同调节。     

斜带石斑鱼人工育苗技术的初步研究

从广东引进斜带石斑鱼受精卵1.5kg(约2.2×106粒),孵出仔鱼约1.8×106尾,在水温25.0～28.8℃、盐度25.6～28.4、溶解氧5.7～7.3mg/L的条件下,使用海水小球藻、牡蛎受精卵和担轮幼虫、轮虫、卤虫无节幼体、蒙古裸腹溞、不同规格的微颗粒配合饲料和鱼糜进行饲喂,经72 d培育出平均全长44.1mm的幼鱼约3.05×104尾,育苗成活率达1.7%.     

斜带石斑β-珠蛋白cDNA的克隆和序列分析

从斜带石斑EpinephelusCoioides白细胞cDNA库随机挑取噬菌斑，做为模板，用λTriplEx5'3'长距离插入子筛选引物，进行插入片断的PCR扩增，并进行表达序列探针（ESTs)测定。从中克隆到了血红蛋白β亚基cDNA,cDNA包含长达444bp的开放阅读框，编码147个氨基酸的多肽。用www.expasy.ch网站的compute pI/MW程序计算其可能的相对分子质量为16544，等电点为6.95。其氨基酸序列与草鱼β-珠蛋白Ⅲ的同源性最高，为73.0%。在远端和近端的与血红素结合的组氨酸都是保守的，另外，与其它鱼类及蛙，鸡和人的β-珠蛋白比较，在血红素结合区及亚基结合区的氨基酸残基均是高度保守的。     

草鱼脂肪酸去饱和酶和延长酶基因cDNA全序列的克隆与分析

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏中控制高不饱和脂肪酸(HU-FA)合成的脂肪酸去饱和酶(FAD)和脂肪酸延长酶(ELO)基因cDNA全序列.结果表明,草鱼FAD基因cDNA全长为1 994 bp,开放阅读框(ORF)为1 332 bp,编码444个氨基酸...     

斜带石斑鱼亲鱼强化培育及自然产卵研究

通过对斜带石斑鱼（Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓ ｃｏｉｏｉｄｅｓ）亲鱼进行强化培育,使其达到自然产卵的目的。强化培育的３批亲鱼（共９１尾）在７７ｄ里共产卵１２０天次,产卵量达２６２７６．８万粒,其中上浮卵１８４５２．９万粒,上浮卵率为７０．２％,上浮卵的受精率为９２．５％。另外,斜带石斑鱼的产卵与水温的关系密切,最适的产卵水温在２４～２７℃之间。     

福尔马林处理对石斑拟合片盘虫和斜带石斑鱼的影响

20 0 0年 4月研究了斜带石斑 Epinepheluscoioides寄生拟合片盘虫Pseudorhabdosynochusepinepheli的防治方法。海水福尔马林对拟合盘虫的作用表现为 :2 5min处理的半致死浓度为 2 5 0× 10 - 6 ,5 0min处理的半致死浓度为 5 0× 10 - 6 。淡水福尔马林的效果为 :3min的半致死浓度为 83× 10 - 6 ,纯淡水处理的半致死时间为 2 1min。海水福尔马林对斜带石斑的毒性表现为 :30min和 4 5min的半致死浓度分别为 94 0× 10 - 6 和 6 4 5× 10 - 6 。淡水福尔马林对斜带石斑的毒性表现为 :5min和 10min的半致死浓度分别为 130 0× 10 - 6 和 5 0 0× 10 - 6 。福尔马林处理海水中的斜带石斑半致死浓度介于 6 0 0× 10 - 6 ～ 10 0 0× 10 - 6 ,淡水处理对斜带石斑半致死浓度介于 95× 10 - 6 ～ 115×10 - 6 。淡水中斜带石斑的半麻醉和半致死时间分别为 95min和 115min。以上结果表明 :海水和淡水福尔马林对石斑拟合片盘虫的致死浓度 ,处于斜带石斑的安全范围之内。     

冰鲜杂鱼与颗粒饲料对斜带石斑鱼的对比饲养效果

选择冰鲜杂鱼和2个市场反映较好的石斑鱼配合饲料产品,分别对斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)进行饲喂效果实验,通过生长性能、体成分、群体离散度以及养殖成本分析,评价冰鲜杂鱼和配合颗粒饲料在斜带石斑鱼养殖效果上的优劣.同一批培育的斜带石斑鱼幼鱼,随机分成3组(冰鲜杂鱼组、石斑鱼颗粒饲料1组和石斑鱼颗粒...     

斜带石斑鱼TLR5S基因结构及功能分析

Toll样受体5(Toll-like receptor 5,TLR5)属于先天免疫系统中的一种模式识别受体(PRR),可分为可溶型和跨膜型2种.它可以识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP),从而启动信号转导.本研究从NCBI数据库中得到斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)可溶型TLR5(ECTLR5S)cDNA全长序列(Genbank登录号:GQ396667).其cDNA序列全长2 439bp,包括69bp的5′UTR,435bp的3′UTR和1 935bp的开放阅读框,共编码644个氨基酸,预测编码蛋白质分子质量为72.28ku,等电点为6.37.将ECTLR5S基因氨基酸序列与其他脊椎动物的TLR5S基因氨基酸序列进行比对,结果显示出很高的相似性,其中与牙鲆相似度可达69%.Real time PCR检测结果显示ECTLR5S基因在斜带石斑鱼不同器官中均有表达,其中在肝脏中的表达量最高,其次是脾脏、血淋巴、肾脏等.Realtime PCR检测ECTLR5S基因在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染3,6,12,24,48h后的肝脏中表达情况,结果显示ECTLR5S基因在3,6,12,24h时表达量显著上调(p<0.05),而在48h下降至初始水平.这些结果说明ECTLR5S基因可能参与到斜带石斑鱼抗弧菌感染的免疫反应中,并且肝脏是其发挥作用的重要器官.