酵母诱导子对肉苁蓉细胞悬浮培养影响的研究

目的:以酵母诱导子对肉苁蓉细胞悬浮培养及其抗氧化活性成分苯乙醇苷的合成动力学的影响进行研究.方法:从肉苁蓉种子诱导出愈伤组织,在MS培养基上进行细胞悬浮培养.首先考察肉苁蓉细胞生长和苯乙醇苷合成的动力学,在此基础上就酵母诱导子对细胞生长和苯乙醇苷合成的影响进行研究.结果:肉苁蓉悬浮细胞培养经过三天的延滞期后进入对数生长期,21天后细胞生长进入稳定期,最大生物量和苯乙醇苷产量分别达到8.03g DW/L和97 mg/L.在对数生长期后期,即培养的第18天加入0.8 mL/瓶浓度的酵母诱导子,诱导三天的效果最好,苯乙醇苷的最高产量为237.7 mg/L,为对照的239%.结论:合适浓度的酵母诱导子不但能够有效提高肉苁蓉细胞悬浮培养液中的苯乙醇苷含量,同时对细胞生长也具有促进作用.     

成人骨髓基质细胞的体外培养

本研究从成人的髋骨抽取骨髓液，离心后将骨髓基质细胞悬液接种培养，待细胞贴壁融合后，进行传代扩增培养．并采用流式细胞术进行细胞周期分析，结果表明原代培养和传代培养的细胞均为贴壁、形态不一的骨髓基质细胞，且此体外培养的骨髓基质细胞具有很强的增殖能力．本研究成功地建立了一套完整、简单、可行的体外分离、长期培养扩增人骨髓基质细胞(Human Bone Marrow Stromal Cells hBMSCs)的系统，证明成人骨髓基质细胞能够在体外长期增殖，为人的骨髓基盾细胞的理论研究和临床应用奠定了基础.     

肿瘤患者自体CIK细胞治疗及其对患者免疫功能的影响

目的　从恶性肿瘤患者外周血中高效诱导扩增CIK细胞并观察自体CIK过继免疫治疗对患者免疫功能的影响.方法体外利用抗CD3单抗、IL 2、γ IFN等细胞因子从12例肿瘤患者外周血单个核细胞(PBMC)中诱导扩增CIK细胞,分3次自体回输;并用流式细胞仪检测回输前后患者T细胞亚群和NK细胞变化.结果　CIK细胞经13d培养后细胞总数和CD3+CD56+T效应细胞均获得大量增殖,分别平均增殖123(46～301)倍和1656(177～5130)倍.肿瘤患者经自体CIK细胞免疫治疗后,CD3、CD4T细胞和NK细胞比例均显著提高(P<0.01).结论　可从不同恶性肿瘤患者PBMC中高效诱导扩增CIK细胞;自体CIK细胞过继免疫治疗可以显著提高患者免疫功能,且副作用小,具有良好的应用前景.     

三叶半夏细胞悬浮培养和植株再生的研究

三叶半夏幼嫩叶片在MS+2,4-D2.0mg/L+BA0.5mg/L培养基上一个月内可以诱导出愈伤组织.取颜色鲜黄的愈伤组织进行悬浮振荡培养,经3～4次继代培养得到分散性好的细胞悬浮系.悬浮培养过程中细胞生长曲线呈S型,培养12～16d达对数生长期,细胞鲜重在第18d达到最大值.悬浮液pH值的变化在对数生长期同生长曲线一致.将细胞悬浮液过滤得到的小细胞团接种于MS+NAA0.2mg/L+BA1.0mg/L分化培养基上,40d分化出小植株.     

人LAK细胞的诱导及其体外抗肿瘤作用

采用IL－2或IL－2＋PHA－P对人外周血单核细胞进行体外淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK、LI－LAK细胞）的诱导及对其体外抗肿瘤细胞活性进行研究，结果显示：300～500IU／mL．IL－2＋5μg／mLPHA－P，孵育时间8～10d为最适的诱导条件，最高可诱导细胞增殖100倍以上。诱导出的LAK及LI－LAK细胞对数种自然杀伤细胞（NK）敏感或不敏感的瘤细胞均有明显杀伤作用。实验还显示，PHA－P的主要作用可能是促进细胞扩增，而非肿瘤杀伤活性的诱导。     

乌龟脑和肝组织细胞的体外培养

以乌龟脑和肝组织为材料,用φ=20%胎牛血清的DMEM培养液进行体外培养,同时也对肾、心肌、脾脏、尾部肌肉等组织进行了体外培养,结果表明:原代培养的脑细胞(TBCs)和肝细胞(TLCs)生长良好,传代TBCs前3代生长稳定,第4代出现聚集生长,第5代出现"自发转化"现象,至12代,"转化"后的细胞体系生长旺盛;TLCs传代后不易增殖,第3代出现衰退;肾脏细胞在培养过程中有少量贴壁;心肌、脾脏、尾部肌肉的细胞培养都不成功。     

嗜凤梨果蝇(Drosophila ananassae)细胞系的建立及其生物学特性初步观察

为建立真核基因表达受体系统,以嗜凤梨果蝇胚胎为材料,采用常规方法获取发育4～8h的果蝇胚胎细胞,以改良M3(BF)培养液体外培养,经40d左右的原代培养后行传代培养,以后每隔7d传代一次,传至10代时按照细胞系建立标准检测细胞系的一系列生物学特性.结果显示:细胞维持体外生长将近1年,传至60代.细胞在接种的0～96h内呈指数生长,临界增殖浓度为1.0×106个(细胞) mL.部分细胞染色体呈现异倍化.经液氮冻存的细胞复苏后活性达90%以上.该细胞系是一株成功的细胞系,命名为HY-ANA.     

一种人外周血NK细胞高效扩增的方法

目的 探索从人PBMC中高效扩增CD3~- CD56~+NK细胞的方法。方法 使用干细胞生长培养基,在抗CD3单抗和IL-2的作用下,从健康成人PBMC中诱导扩增CD3~- CD56~+NK细胞,并用流式细胞仪检测扩增细胞的免疫表型。结果 PBMC经抗CD3单抗、IL-2联合作用获得大量增殖,在14d时扩增54.3±5.5倍,含有(52.4±7.9)％CD3~- CD56~+NK细胞。结论 可使用干细胞生长培养基,在抗CD3单抗和IL-2协同刺激下大量扩增NK细胞,为应用NK细胞进行肿瘤过继免疫治疗提供了一种简单有效的扩增NK细胞的方法。     

恶性实体瘤患者自体CIK细胞的体外大量扩增后的免疫表型变化

目的:回顾性分析我院2009年1月至2010年5月行细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)治疗的59例实体瘤患者的自体CIK细胞体外扩增后免疫表型的变化,为恶性实体瘤患者开展CIK细胞治疗提供实验依据。方法:采集59例恶性实体瘤患者外周血单个核细胞,培养体系加入IFN-γ、CD3McAb及IL-2三种细胞因子体外诱导,培养10～14 d;用流式细胞仪分别检测CIK细胞培养前后的免疫表型,进行配对t检验。结果:CIK细胞培养后单个核细胞,CD3+细胞,CD3+CD4+细胞,CD3-CD56+细胞,CD3+CD56+细胞均较培养前增加,差异有统计学意义(P<0.05)。CD3+CD8+细胞,虽然较前增加,但差异无统计学意义(P>0.05),CIK细胞中CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD3-CD56+表型的细胞比率与培养前相比均有所下降,差异有统计学意义(P<0.05),但CD3+CD8+细胞比率与培养前差异无统计学意义(P>0.05)。而CIK细胞的纯度从培养前(9.90±8.96)%增至(46.55±19.25%),差异有统计学意义(P<0.05)。结论:恶性实体瘤患者自体CIK细胞体外扩增后,CIK细胞纯度显著增加。     

多波形超声波辐照对啤酒酵母细胞生长的影响

研究了四种波形的超声波对啤酒酵母细胞生长的影响。在细胞生长的调整期进行超声辐照时,各种处理对细胞生长都有不同程度的促进作用,其中第三波形的效果最好,在对数生长期进行处理时,对细胞生长有抑制作用,且前期处理效果最发的波形对后期的抑制作用也最明显,在平衡期进行处理,对细胞生长没有明显影响。     

建立人输卵管上皮细胞无血清培养

人输卵管上皮细胞（HOEC）可以体外较长时间无血清培养,DMEM／F12培养液的培养效果优于Ham’sF10,在加有多种因子和胎球蛋白的培养液中,HOEC可贴壁生长,生长能力达到合质量分数15％FCS的对照组的30％～40％,一般可传代2次,最长培养可维持38d,细胞形态与有血清培养差别不大,虽然无血清培养HOEC的生长速度、密度、传代成功率远不及有血清培养,但能抑制成纤维细胞生长,维持较纯的上皮细胞。     

人骨髓间充质干细胞对小鼠神经干细胞增殖与分化培养的影响

通过在体外培养、鉴定人的骨髓间充质干细胞与小鼠神经干细胞,用骨髓间充质干细胞条件培养基分别在增殖与分化条件下对神经干细胞进行培养.发现,间充质干细胞条件培养基在增殖条件下能加快神经球内神经干细胞的迁移,使神经球解聚,对神经干细胞增殖没有影响;而间充质干细胞条件培养基在分化条件下,能增加神经干细胞向少突胶质细胞分化的能力,降低向星型胶质细胞的分化能力,对向神经元分化能力没有影响,间充质干细胞可能是通过促进神经干细胞迁移、分化而加快神经损伤的修复的.     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养

目的探讨小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的分离与培养。方法取BALB/c小鼠胚胎分离成纤维细胞,利用体外培养体系,对MEF的生长形态进行观察,并对传代细胞培养液、胚胎胎龄、胰蛋白酶浓度进行筛选。结果 MEF在体外为贴壁生长型细胞,第三、四、五代细胞纯度较高且增殖最为旺盛;添加血清的M199和DMEM均能较好的满足原代细胞的生长,两种培养液中细胞增殖的速度无明显差异;11.5～16.5d胎龄的小鼠胎儿MEF分离效果最好;0.1%胰蛋白酶消化MEF时间以8～11min为宜。结论通过对MEF分离培养影响因素的筛选,为MEF的进一步研究奠定了基础。     

小鼠孤雌生殖胚胎干细胞的分离及分化潜能研究

用免疫外科法从小鼠孤雌生殖胚胎分离胚胎干细胞,并研究了其在体内、体外的分化潜能．结果发现:从小鼠孤雌生殖的胚胎中可分离出胚胎干细胞(pES),可以传代培养25代,能表达很强的碱性磷酸酶,核型稳定呈40XX．培养至第18代的pES在体内可诱导肿瘤形成,并可分化为三个胚层的组织细胞．免疫组化结果显示:神经细胞特异性烯醇化酶（NSE）、肌肉特异性肌动蛋白?-actin均呈阳性,表明分离培养的pES在体内可至少分化为来自外胚层和中胚层的组织细胞．传至第20～24代的pES细胞,经体外定向诱导分化,可定向分化为节律性收缩的心肌细胞及神经细胞．免疫组化检测显示节律性收缩的心肌细胞表达?-actin,而神经细胞表达NSE．结果表明:利用免疫外科法可从孤雌生殖的小鼠胚胎建立pES,这些pES在体内、体外都具有分化为多种类型细胞的潜能．     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及生物性状研究

分离培养人骨髓间充质干细胞，研究其在体外生长增殖的生物特性。冲洗手术弃骨骨髓，获取骨髓间充质干细胞进行培养，倒置相差显微镜观察细胞生长情况，绘制生长曲线，免疫细胞化学法鉴定细胞表面抗原，进行染色体核型分析。冷冻保存细胞复苏后的生长状况观察。结果显示，原代和传代培养的细胞呈现梭形外观，具有较强的生长增殖能力；细胞CD44，CD54抗原表达阳性，CD34表达阴性。染色体核型分析表明是正常的人二倍体细胞。复苏细胞生物学特性无明显改变。     

BHK-21细胞在生物材料溶液中黏附及增殖比较

目的比较BHK-21细胞在3种生物材料溶液中黏附及增殖情况,探讨以类人胶原蛋白为基础制备组织工程材料的可行性。方法将BHK-21细胞分别种植于类人胶原蛋白、壳聚糖、透明质酸以及共混溶液中,在倒置显微镜下观察细胞的黏附和生长情况,并利用MTT方法检测种植后1～5 d细胞的增殖情况。结果BHK-21细胞种植12 h,类人胶原蛋白、壳聚糖以及两者共混溶液能显著促进BHK的黏附(P<0.01);BHK-21细胞在类人胶原蛋白溶液及类人胶原蛋白与其他生物材料共混溶液中功能活跃,维持其形态且能持续增殖,其中类人胶原蛋白/壳聚糖共混溶液促细胞增殖能力最强。结论类人胶原蛋白能够维持BHK细胞的生长与繁殖,在组织工程领域是一种极有潜力的组织工程材料。     

人脂肪组织来源干细胞生物学特性研究

为进一步研究脂肪组织来源的干细胞增殖和多向分化潜能,用改进的方法分离脂肪组织来源的干细胞,通过cck-8检测细胞的增殖能力、流式细胞仪检测干细胞相关表面标记的表达、RT-PCR对干细胞相关基因的表达进行分析;并对分离得到的细胞向脂肪、软骨、骨及心肌细胞诱导,观察其多向分化能力.结果显示:采用改进的方法,从400～600 mg脂肪组织可收获约5×105个脂肪组织来源的干细胞,并且细胞可以重叠生长1个月以上,期间细胞表现出几个对数增殖期;所有增殖的细胞其干细胞相关表面标记都呈阳性表达;转录因子Nanog、Oct-4、Sox-2和Rex-1也呈强阳性表达;ADSCs向脂肪、骨、软骨和心肌细胞诱导分化后能够分别表达脂滴、碱性磷酸酶和矿化结节、富含黏多糖的软骨细胞外基质,以及少量心肌特异性连接蛋白Connexin-43,表明ADSCs具有向多个胚层细胞分化的能力.此外,为获得更多具有强增殖能力的细胞,根据生长曲线,对细胞进行每14 d传代而非传统的5 d传代,发现所得到的细胞仍保持强的增殖能力、干细胞表型以及更强的多向分化潜能.     

兔骨髓间充质干细胞复合脱细胞牛松质骨体外相容性研究

探讨脱细胞牛松质骨（Acellular Bovince Cancellous Bone，ABcB）生物衍生材料与骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）的生物相容性，为组织工程方法修复骨缺损提供依据。将兔骨髓间充质干细胞与ABCB复合并体外培养，然后进行形态学、细胞增殖、蛋白质含量测定。骨髓间充质干细胞能够贴附在ABCB孔隙内生长，细胞生长及蛋白合成功能不受ABCB的影响。ABCB生物相容性良好，可作为组织工程的支架材料应用于骨缺损的修复；BMSCs可以作为骨组织工程种子细胞。     

高原环境心肌细胞体外生长特性研究

目的：研究高原环境心肌细胞体外生长特性,作为高原环境研究心肌细胞功能的实验基础。方法：将心肌细胞系复苏后使用体积分数为0.15的高糖DMEM培养基接种于33mm培养皿中并置于37℃5%CO2培养箱中进行培养;台盼蓝染色法检测细胞的成活率,并观察心肌细胞的形态变化,CCK8法绘制细胞生长曲线,血球计数法进行细胞计数。结果：心肌细胞最初接种时呈圆形,24小时后细胞贴壁生长;4天后细胞有伪足伸出,细胞呈梭形、多角形等形态,大小均匀,生长迅速,7天后细胞逐渐形成细胞簇,11天后细胞簇相互连接成片生长,达90%融合时进行传代;计数1000个细胞,蓝染细胞48个,成活率为95.20%;生长曲线显示细胞生长过程分为潜伏期、对数生长期和平台期三个阶段。结论：高原环境能够进行体外心肌细胞培养。