H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及原核表达

克隆、表达和纯化禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为筛选与NS1相互作用的宿主蛋白以及深入研究NS1蛋白的功能打下基础.根据GenBank中收录的H5N1亚型禽流感病毒NS1基因序列,设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增AIV NS1基因,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-28a载体上,经酶切分析及序列测定正确后,鉴定出NS1基因的阳性重组子.阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用1 mmol/L IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测,获得预期蛋白的表达,通过Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对NS1蛋白进行纯化.结果成功克隆H5N1亚型AIV的NSl基因,其核苷酸序列长度为678 bp,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,表达产物在上清及包涵体中均有表达.经纯化,目的蛋白纯度高达90%,成功表达纯化出28KD的NS1融合蛋白并鉴定其免疫学活性.成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为进一步研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础.     

小鼠Pem-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达

目的：为制备重组小鼠Pem（以下简称mPem）-谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合蛋白，作为研究mPem蛋白功能的材料，方法：根据携带小鼠Pem基因编码序列的模板质粒pEGFP/mPem设计合成特异性引物，PCR扩增小鼠Pem基因编码序列，并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-3中，得到重组表达质粒pGEX-4T-3/mPem，用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞，IPTG诱导重组菌表达mPem蛋白，SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达产物。结果：重组菌株明显诱导表达出预期相对分子质量49000的融合蛋白。结论：成功构建了mPem-GST原核表达质粒，并在大肠杆菌中表达出mPem-GST融合蛋白，为mPem蛋白功能的研究打下了基础。     

pQE30-bgln原核表达质粒的构建和鉴定

构建重组原核表达质粒pQE30-bgln使之可以在大肠杆菌中表达以获得β-葡糖苷酶,用于提高从植物中提取白藜芦醇的得率.以克隆质粒pUCP67为模板,用降落PCR的方法扩增β-葡糖苷酶基因片段(bgln).利用原核表达载体pQE30构建pQE30-bgln重组质粒,用酶切电泳验证重组结果的正确性,测序检测质粒重组后序列情况.PCR结果显示扩增片段2.2 kb,与预期相同.重组质粒酶切后显示其大小约5.6kb,大小及酶切图谱与预期相同.经测序发现插入片段读码框正确.可用于原核表达的pQE30-bgln质粒构建成功.     

F3重组毒素的克隆表达及纯化

以pEKH-F3质粒为模板,PCR扩增F3片段,将F3插入克隆质粒PQE80L,转化大肠杆菌,筛选,获得含有F3的PQE80L重组载体的克隆.提取绿脓杆菌菌株染色体DNA为模板,PCR扩增绿脓杆菌外毒素A催化区,PE40.然后将PQE80-F3和PE40重组,得到表达PQE80L-F3-PE40载体.转化至大肠杆菌DH5a,BL21,表达融合蛋白F3-PE40.结果显示,大肠杆菌表达了融合蛋白F3-PE40,表达的融合蛋白量大概占菌体总体蛋白量的20%.通过质粒提取、PCR扩增构建F3-PE40表达载体转化大肠杆菌,成功地表达了融合蛋白F3-PE40,为大规模表达、纯化F3-PE40的进一步功能奠定了基础.     

截短型HCV NS5B RNA聚合酶在大肠杆菌中表达纯化及鉴定

为构建HCV截短型ns5bΔ21基因的原核表达质粒;在大肠杆菌中表达NS5B蛋白并纯化,制备其抗体。运用软件设计引物,以BB7复制子为模板PCR扩增ns5bΔ21基因;克隆入原核表达载体pRSETA。将重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21转化BL21大肠杆菌,并诱导表达、可溶性分析及纯化;用纯化的NS5B蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果酶切鉴定和序列测定表明成功的构建了重组表达质粒pRSETA-ns5bΔ21;其经IPTG诱导后行SDS-PAGE可见新生表达条带,Western-blot证实了其特异性和抗原性良好;利用镍离子亲和层析和电洗脱方法获得了纯化NS5B蛋白;用纯化蛋白免疫小鼠制备出了多价抗血清。说明表达和纯化的截短型HCV NS5B RNA聚合酶可用于下一步筛选单链抗体。     

赤红球菌JDM312株环己酮单加氧酶基因的克隆和序列分析

应用PCR从赤红球菌JDM312株基因组DNA中扩增出chnB基因序列,构建pUC18-chnB重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,并对插入片段进行测序,用Clustal X和Mega 3.1软件对测定DNA序列进行相似性和系统发育分析.结果显示：扩增得到的chnB基因大小为1 623 bp,编码由542个氨基酸残基构成的...     

人TCTP基因的克隆与原核表达

人翻译控制肿瘤蛋白（hTCTP）是一个在进化过程中高度保守且具有很高表达量的蛋白家族。本实验通过PCR技术扩增人hTCTP基因,经酶切后插入表达质粒pGEX-4T-2构建表达载体,转化大肠杆菌后挑选阳性菌进行菌落PCR及质粒酶切鉴定,确证克隆成功并构建了人hTCTP基因表达载体。重组表达载体经IPTG诱导表达出目的蛋白,用超声破碎、亲和层析和SDS-PAGE对目的蛋白进行了分离纯化并鉴定。     

VMIP—Ⅱ肽在大肠杆菌中的双辅助助子高效表达

目的构建病毒趋化因子(vMIP-II)基因表达载体并在大肠杆菌中以辅助折叠和辅助阻遏方式高效表达vMIP-II重组肽. 方法用PCR法获得vMIP-II基因片断,将其插入表达载体pQE,构建重组表达载体pEh-vMIP. 表达载体、辅助折叠子和辅助阻遏子载体共转染大肠杆菌DH5α,用酶切、DNA测序、PCR扩增鉴定阳性克隆. 结果阳性重组子在大肠杆菌细胞中经IPTG诱导可高效表达vMIP-II重组肽,蛋白电泳分析可观察到一相对分子质量与理论值相符(约8×103)的诱导表达条带, 其表达量约占菌体总蛋白的20%. 分析表明,vMIP-II重组肽主要以可溶性形式表达. 结论用双辅助技术在大肠杆菌中高效表达较小相对分子质量vMIP-II的成功,为进一步研究vMIP-II的功能及应用奠定基础,也为同类小分子、易降解的肽类物提供基因工程表达方法.     

Hirulog 18在大肠杆菌中的表达及其生物学活性检测

以化学合成的Hirulog18基因为模板,经PCR扩增、限制性内切酶Xho Ⅰ和Kpn Ⅰ消化,将编码Hirulog18的基因片断插入表达载体pET-32b中编码硫氧化还原蛋白（Trx）基因序列的下游.用重组质粒转化感受态大肠杆菌-BL21（DE3）,并用IPTG诱导表达Trx-Hirulog18融合蛋白.复性、肠激酶酶切、Ni-Sepharose和HPLC纯化后,用质谱测定其分子量并进行活性测定.检测结果表明构建的PET-302b/Hirulog18能够在大肠杆菌中高效表达,表达的Hirulog18具有较低的凝血酶抑制活性并能够竞争抑制Angiomax活性.     

甘薯储藏蛋白(sporamin)A基因在大肠杆菌中的表达研究

利用基因重组技术,将ＰＣＲ扩增获得的甘薯储藏蛋白Ａ基因的成熟肽编码区序列,插入到高效表达载体ｐＴｒｃＨｉｓＢ中,构建成重组表达质粒ｐＴＨＳＰＯ－Ａ,用限制酶切和ＰＣＲ分析均表明重组质粒与预期结果相符,用ＩＰＴＧ诱导重组质粒转化的大肠杆菌ＴＯＰ１０。菌体总蛋白经１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,可观察到一个大小为１０ｋＤ的蛋白质带,其分子量比预期值小。     

人类扭转蛋白A的基因克隆、表达与蛋白质纯化(I)——DYT1基因克隆与原核表达

通过基因工程方法,用大肠杆菌原核表达系统表达人扭转蛋白A.从该蛋白编码序列中设计引物,以人肝cDNA文库作模板扩增到编码该蛋白的基因片段.将所得片段与pMD l8-T载体连接,转化到JM l09大肠杆菌中,从转化平板上挑出菌落,用碱裂解法提取质粒,通过PCR和酶切分析,筛选到阳性克隆,测序结果与文献报道结果一致.提取质粒,用BamHI和XhoI酶切,回收目的片段,分别克隆到原核表达载体pET28a( )和pGEX-6P-1中,转化JM l09受体菌,从JM l09受体菌中提出质粒,再转化到BL21(DE3)菌中,筛选出阳性克隆,构建了人扭转蛋白A原核表达载体.IPTG诱导该工程菌,培养并离心收集.SDS-PAGE结果表明该蛋白在两种载体中均得到了高效表达.     

鸡白细胞介素2基因的克隆、原核表达及功能研究

以RT-PCR法从鸡脾脏细胞中扩增出鸡白细胞介素2编码基因,通过双酶切、连接步骤克隆进原核表达载体pQE30及pGEX-4T-3,构建了鸡白细胞介素2基因的重组原核表达质粒pQE30-chIL-2及pGEX-chIL-2.重组质粒转化大肠杆菌JM109后经诱导表达,分别得到两种表达产物.以SDS-PAGE和Westernblot检测确认表达产物为带6组氨酸标签及GST蛋白的融合鸡白细胞介素2,分子量分别为16 kDa及39.5 kDa.表达蛋白与抗鸡白细胞介素2单抗均有良好的免疫结合性,进一步证实为鸡白细胞介素2.表达产物经过纯化复性后,具有明显促进鸡脾淋巴细胞增殖的作用.     

钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32基因的克隆和表达及其在ELISA检测中的应用

钩端螺旋体 (钩体 )病是一种全球性的人兽共患病。人类感染钩端螺旋体后表现出多种器官和系统病变 ,愈后不良 ;也可垂直传播感染胎儿 ,引起流产。动物中 ,犬钩端螺旋体的感染率较高 ,感染后 ,临床表现多样 ,大多呈隐性感染 ,不发病 ,但钩体在肾脏中长期存在 ,持续随尿液向外排菌。由于钩端螺旋体对人的强致病性 ,以及由动物传播给人引起的严重公共卫生问题 ,因此快速准确地进行钩端螺旋体病的诊断 ,显得尤为重要 ,也是目前钩端螺旋体研究中亟待解决的问题。钩端螺旋体属钩端螺旋体科 ,钩端螺旋体属问号状钩端螺旋体种的成员。目前发现血清型…     

大肠杆菌菌毛抗原K99基因的亚克隆及核苷酸序列测定

利用PCR技术 ,从含有大肠杆菌菌毛抗原K99基因的质粒pX5K中扩增出 0 .4kb的K99菌毛抗原基因 ,然后将其亚克隆到pGEM T easy载体上 ,并转化至受体菌JM10 9中 ,采用碱性裂解法提取质粒DNA后 ,经NcoI和EcoRⅠ双酶切分析和核苷酸序列分析 ,证明插入的K99基因片段具有正确的核苷酸序列     

PMEPA1蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备

为了从蛋白水平上检测前列腺跨膜蛋白PMEPA1(prostate transmembrane protain,androgen induced 1)在细胞内的表达和功能,构建了原核表达重组质粒pTrcHisA-PMEPA1和pGEX4T-2-PMEPA1,转化大肠杆菌BL21-RIPL后,IPTG诱导蛋白表达,分别用Ni-NTA和谷胱甘肽琼脂糖凝胶层析柱纯化蛋白。用His-PMEPA1免疫兔子制备抗体,并用GST-PMEPA1对抗体进行纯化。免疫印迹检测显示抗体能够特异识别细胞中内源PMEPA1蛋白。     

基于关键酶表达的发酵调控与分子改造策略对E.coli产丁二酸的影响

考察E.coli JM001及其重组菌株E.coli JM002生物发酵生产丁二酸的性能。E.coli JM001在两阶段发酵产丁二酸过程中通过在有氧培养阶段添加乙酸钠,即可提高丁二酸的生产能力,厌氧阶段的丁二酸收率可达84%,但会有较多的副产物乙酸和丙酮酸积累。以E.coli JM001为出发菌株,敲除其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)并导入来源于枯草芽孢杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)基因,构建了重组菌株E.coli JM002,该重组菌株在两阶段发酵的有氧培养过程中不需添加乙酸钠,转厌氧后菌株也具有转化葡萄糖合成丁二酸的能力,丁二酸收率可达86%,副产物积累很少。     

Study on interleukin-18 gene transfer into human breast cancer cells to prevent tumorigenicity

To study the effect of interleukin-18 gene transfection on the tumorigenesis of breast cancer cell line Bacp37, human breast cancer cell line Bcap37 were transfected with Lipofectamine and selected by G418. The biological expression of rhIL-18 was tested by RT-PCR and ELISA method; nude mice were injected with Bcap37 cell with or without the hIL-18 gene. The hIL-18 cDNA was successfully integrated into Bcap37 cell; 126.3+/-4.5 pg hIL-18 secreted by one million transduced cells in 24 hours. Nude mice injected with IL-18 gene engineered Bcap37 cell had no tumor growth. These findings indicated that human breast cancer cells were successfully modified by the gene of IL-18 cytokine; the IL-18 gene engineered Bcap37 cells secreted hIL-18 and lost their tumorigenicity. The Bcap37 cells transduced with IL-18 gene may be used as breast cancer vaccine.     

基因工程菌对偶氮染料脱色及生物强化作用

研究了基因工程菌Escherichia(E.)coli JM109(pGEX-AZR)对偶氮染料的脱色及生物强化能力.实验表明,合有10%E. coli JM109(pGEX-AZR)的强化体系对酸冲击的耐受能力没有提高,脱色率仅为80%;而对碱度及盐度的冲击表现出较强的耐受能力,脱色率超过90%.同时在AnSBRs中连续运行42 d,强化体系耐浓度冲击的能力和脱色率均高于对照体系.利用RISA测定微生物群落结构,E.coli JM109(pGEX-AZR)在强化体系中始终作为优势菌群存在并保持较高的代谢活性.     

人血管生成素基因的克隆及表达

利用RI-PCR方法从培养的人黑色素瘤细胞系A375中扩增得到了人血管生成素cDNA片段,测序正确后克隆入表达载体pET-28a( )中并转化于E.coli BL21宿主菌中.经IPTG诱导,表达了N端融合6个组氨酸标签(6His-tag)的血管生成素融合蛋白.利用6His-tag与过渡态金属离子Ni2 高亲和力结合的性质,经镍柱纯化,获得了高纯度的血管生成素融合蛋白,为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础.     

史氏鲟（Acipenser schrenckii）两种促性腺激素β亚基的原核表达

 采用遗传工程方法,重组表达史氏鲟两种促性腺激素β亚基蛋白。选用原核表达载体pET－22b(+),分别插入史氏鲟GtHⅠ&;Ⅱβ亚基成熟肽cDNA序列,构建成C端含有6个组氨酸(6-His)融合蛋白标签的表达质粒;分别转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）并诱导表达2个基因。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示重组融合蛋白相对分子质量分别为：GtHⅠβ亚基大约14 000,GtHⅡβ亚基15 000左右。分别用抗6个组氨酸融合标签的单克隆抗体及兔抗鲟鱼GTH多克隆抗体对2个表达蛋白进行Western Blot分析,结果显示重组蛋白表达正确且有较高的免疫活性。GTHⅠβ重组蛋白在2 h就有明显的表达,6 h后随着时间增加表达量不再增加;25 ℃诱导重组蛋白产量比37 ℃诱导产量低。获得的重组蛋白质将可用于建立鲟鱼GtH的放射免疫测定方法。