在低温下消毒剂对松材线虫的选择毒性

对3种消毒剂(3 % H2O2、4 % NaClO、0.1 % HgCl2)在22~25 ℃(室温)和4~8 ℃(低温)下对松材线虫的培养效果进行研究,线虫经消毒剂处理后用无菌水清洗,然后在肉汤培养基中培养。结果表明：(1)该3种消毒剂能在室温和低温条件下5 min之内杀死松材线虫虫体上分离的所有细菌菌株;同时也能在室温和低温条件下30 min杀死松材线虫匀浆液中的全部细菌。(2)3种消毒剂在低温4.5 h或室温25 min的条件下,不能完全灭菌。(3)3 % H2O2杀菌效果较好,其次是4 % NaClO,0.1 % HgCl2效果较差。(4)3种消毒剂处理后松材线虫的存活时间(表示为消毒剂,在低温条件下存活时间(在室温条件下存活时间))分别为3 % H2O2, 23 h(>3.5 h);4 % NaClO, 8.5 h(3 h);0.1 % HgCl2, 3.5 h(1 h)。结果显示松材线虫携带的细菌可能隐藏在消毒剂不易到达的线虫体表,或线虫的表被层具有对抗这些消毒剂保护细菌的作用。     

细菌分离物B619与松材线虫病关系的初步研究

在无菌条件下,用从松材线虫虫体上分离到的细菌分离物Ｂ６１９、无菌线虫以及它们的混合物对无菌黑松苗进行了接种试验。结果发现,用无菌线虫或细菌分离物Ｂ６１９接种的无菌苗不发病,而把二混合后接种则使无菌苗发生萎蔫。这表明松材线虫携带的细菌与松材线虫的致病性有关,二在致病性上极可能存在着协同作用关系。因此,可以把松材线虫病看作是线虫和细菌共同侵梁引起的复合侵染病害。     

松材线虫和拟松材线虫的繁殖力及其超氧自由基差异

采用不同毒力的松材线虫和拟松材线虫进行研究,探讨不同毒力线虫的繁殖力及虫体自身超氧自由基(O·2)释放能力差异与各虫株致病力之间的关系。对强、弱毒松材线虫和无毒拟松材线虫在单异活体培养下的繁殖力进行测定,发现三者的繁殖力从大到小依次为：无毒拟松材线虫、强毒松材线虫、弱毒松材线虫。单异活体培养下的松材线虫和拟松材线虫虫体、水培滤液的超氧自由基测定表明,两组分中的超氧自由基含量与供试线虫的毒力呈负相关,从高到低依次为：无毒拟松材线虫、弱毒松材线虫、强毒松材线虫。结果表明：供试的不同毒力松材线虫和拟松材线虫的致病力与其繁殖力无显著相关性,但与其虫体超氧自由基含量有密切关系。     

松材线虫与其携带细菌之间的相互影响

笔者研究了从松材线虫体上分离的2 株强致病菌和1 株弱致病菌与松材线虫的相互影响。结果表明:强致病菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) GcM5 1A菌株、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ZpB1 2A菌株能够明显地促进无菌松材线虫的产卵量增加、繁殖速度加快和成虫虫体生长;同时,松材线虫也能促进强致病菌荧光假单胞菌GcM5 1A菌株、恶臭假单胞菌ZpB1 2A菌株的繁殖。而泛菌(Pantoea sp.)ZM2C菌株完全抑制了无菌松材线虫的繁殖,无菌松材线虫对泛菌ZM2C菌株的繁殖亦具有显著抑制作用。由此说明松材线虫与其携带的某些致病菌之间存在互惠共生现象,松材线虫携带的致病菌并不是偶然的污染,它们之间的互惠共生现象是在长期共生进化中形成的。笔者还讨论了互惠共生现象在松材线虫致病过程中的作用。     

不同致病力线虫侵染后黑松的水势和根系活力的变化

分别用强、弱致病力松材线虫虫株和无致病力拟松材线虫虫株接种2年生黑松,观测接种后不同时间段黑松茎段水势和根系活力变化情况。结果表明：接种强、弱致病性松材线虫虫株后,在未表现出明显症状时,黑松水势都有一个降低然后回升的过程,但当树体内线虫开始大量繁殖、外部表现萎蔫症状时,黑松水势发生不可逆转的急速降低,松树死亡,强致病性松材线虫虫株比弱致病性松材线虫虫株导致黑松茎水势丧失速度快。接种无致病力拟松材线虫后,开始黑松水势下降,然后缓慢回升接近正常水势,随着线虫的死亡,树体水势恢复正常。接种3种线虫虫株后,黑松根系活力随着线虫的侵入都有一个升高的过程,接种强、弱致病力松材线虫虫株后,黑松出现萎蔫时,根系活力虽然有所下降,但仍然保持较好的根系活力,直到松树干枯后根系活力才丧失,这与干旱胁迫下,植物首先丧失根系活力然后表现萎蔫不同;接种无致病力拟松材线虫后,随着拟松材线虫在黑松体内的死亡,黑松的根系活力在升高后逐渐恢复正常。     

两株松材线虫拮抗细菌的筛选和鉴定

【目的】筛选对松材线虫具有较高杀线活性的拮抗细菌。【方法】以分离自南京、洛阳、上海的松树茎部的137株内生细菌为研究对象,采用培养滤液和菌悬液浸渍法对这些菌株进行杀线活性的测定,并对筛选的高效拮抗细菌进行菌种鉴定。【结果】通过培养滤液浸渍试验筛选出3株细菌对松材线虫有较高的杀线活性,使用3种菌滤液处理线虫48 h后,线虫死亡率均达到100%,其中菌株LYMC-3的培养滤液还可使线虫虫体出现消解。将3株菌的培养滤液分别稀释2倍、4倍和10倍后处理松材线虫,随稀释倍数的增加,培养滤液的杀线活性逐渐降低。处理线虫48 h后,菌株LYMC-3的10倍稀释滤液与其他两株菌滤液相比对线虫的致死率最高,为94.7%; 在菌悬液浸渍试验中筛选出菌株NJSZ-13对松材线虫有较高杀线活性,10⁵ cfu/mL 浓度的菌悬液处理线虫48 h后,线虫死亡率达81.5%。通过对LYMC-3和NJSZ-13菌株的形态特征、生理生化特征、Biolog鉴定和16S rDNA序列以及系统发育分析,确定菌株LYMC-3、NJSZ-13分别为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。【结论】从松树体内筛选到两株对松材线虫有高效拮抗活性的菌株LYMC-3和NJSZ-13,对生物防治松材线虫病具有潜在的应用价值。     

细菌XSJS3对松材线虫杀线活性的测定

细菌XSJS3是一种新发现的对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)具有较高杀线活性的细菌,试验比较了细菌XSJS3培养液、细菌培养液滤液及含菌体水溶液对松材线虫的杀线活性,结果发现细菌菌体本身对松材线虫无杀线活性,杀线活性物质存在于细菌的培养液滤液中。通过对该细菌培养液滤液对松材线虫致死过程的观察发现:松材线虫接触该细菌培养液滤液30min后就表现为行动迟缓;在5h后所有虫体均不活动,针刺无反应;24h后部分僵直虫体出现局部膨大,且膨大部位出现体液外渗而虫体最终被消解。对不同培养时间的细菌XSJS3滤液杀线活性的比较试验表明:该细菌分泌的杀线物质在10d内随培养时间的延长而含量增加,杀线活性逐渐提高,不同培养时间下滤液的杀线活性差异明显;但培养15d后,稀释10倍的滤液对松材线虫杀线活性比培养10d时同样滤液的杀线活性则略有下降,但差异不明显,因此获得该细菌分泌的杀线物质较理想的培养时间为10d。将细菌XSJS3培养液滤液进行不同温度的热处理后测定对松材线虫的杀线活性,结果表明引起松材线虫死亡和消解的物质是两个不同物质,存在于培养液滤液中的对松材线虫有杀线活性的物质是热稳定的,而引起松材线虫虫体消解的物质是热不稳定的。     

松材线虫携带细菌数量的测定及无菌松材线虫的培养

对来源于自然条件和常规培养条件下的松材线虫携带的细菌数量进行了测定 ,并采用黑松愈伤组织对松材线虫进行了纯培养。结果表明 ,自然感病的黑松病组织中的松材线虫携带活细菌的数量平均为 2 .9× 10 2 个 条 ,灰葡萄孢菌丝上培养的松材线虫携带活细菌的数量平均为 3.0× 10 3 个 条 ;来源于自然感病的黑松和马尾松上的松材线虫 ,经无菌处理后 ,在黑松愈伤组织上生长良好 ,用 3g新鲜愈伤组织培养 9d ,虫口数量可达 10万余条。     

黑松与松材线虫和拟松材线虫互作早期超氧自由基研究

为探讨黑松受不同毒力松材线虫与无毒拟松材线虫侵染后,超氧自由基(O2.-)在互作早期对松材线虫病发生发展的作用,采用2年生黑松接种强毒、弱毒松材线虫与无毒拟松材线虫,于接种后4、12、24、48、72、96、120 h对受侵染黑松的茎干和针叶取样测定。结果表明:黑松受不同毒力供试线虫侵染后体内O2.-和SOD活性变化差异显著。接种后12 h,松树茎、叶中的O2.-均出现第1次突增,茎部突增的强度与供试线虫毒力呈负相关,在针叶内O2.-出现第2次突增,且无毒拟松材线虫处理(48 h)的启动时间早于强毒松材线虫(72 h)的。SOD活性在接种无毒拟松材线虫的松树茎、叶中出现两次突增,而接种强毒松材线虫的处理仅出现1次突增。3种处理黑松茎、叶的Mn-SOD含量在24 h后第1次突增,且接种无毒拟松材线虫的高于接种强毒松材线虫的。O2.-与SOD的变化趋势在一定程度上呈正相关关系,但SOD的特异变化滞后于O2.-的变化。由此可见,超氧自由基可能是松树受松材线虫侵染后进行信号转导的重要桥梁物质。     

松材线虫体内细菌对宿主繁殖和致病力的影响

为探讨松材线虫体内细菌在松材线虫病中的作用,对无菌松材线虫、体内细菌处理的松材线虫和野生型松材线虫的繁殖量和致病力进行了测定。结果表明:在非寄生条件下,无菌松材线虫的产卵量、卵孵化率和繁殖量显著高于携带细菌的松材线虫; 松材线虫体内寄生菌嗜麦芽窄食单孢菌NSPmBx03胞外代谢产物对松材线虫产卵量具有一定抑制作用。不同处理的松材线虫接种到3年生马尾松后,其繁殖量从高到低为野生型松材线虫>体内细菌处理的松材线虫>无菌松材线虫。对马尾松发病情况观察发现:接种野生型松材线虫的马尾松发病最早,病程最短; 次之为接种体内细菌处理的松材线虫; 最后是接种无菌松材线虫的处理。这表明嗜麦芽窄食单胞菌NSPmBx03对松材线虫在寄生和非寄生条件下繁殖的影响不同,对松材线虫致病力有一定增强作用。     

松材线虫体表物质与其携带细菌的关系

松萎蔫病是由松材线虫与其所携带的细菌复合侵染所引起。为进一步明确松材线虫与其携带细菌的关系,笔者用无菌线虫体表浸泡物处理细菌,再将无菌线虫各虫株与细菌共培养,结果表明细菌的存在可促进线虫的繁殖,线虫体表浸泡物质可促进细菌繁殖,无菌线虫与细菌共培养后线虫繁殖数量较无菌线虫单独培养有明显增加,说明松材线虫与其体表细菌的关系为一种互惠关系。此外还设计了无菌线虫对细菌的趋向性试验,考察线虫与自身体表所携带细菌之间的趋向性是否具有特异性,结果表明所有无菌线虫对成团泛菌具有明显的趋向性,各无菌松材线虫对于分离自各自体表的细菌菌株没有特异的趋向性。     

松材线虫低温冷冻保存研究

为满足大量松材线虫虫株长期保存的需要,对其低温冷冻保存技术进行了研究。试验比较了不同种类及浓度冷冻保护剂对松材线虫在低温冷冻保存时的保护效果,以及冷冻线虫繁殖力与致病力的变化。结果表明:使用15%甘油和4%DMSO作为冷冻保护剂,经-80℃保存1 d后,松材线虫存活率分别为(39.4±6.6)%和(37.5±21.8)%,且冻存10 d、1个月后均没有显著性下降。与未冷冻的线虫相比,冷冻线虫的繁殖力与致病力均未发生改变。     

Production of sperm reduces nematode lifespan.

Sex and death are two fundamental but poorly understood aspects of life. They are often thought to be linked because reproduction requires the diversion of limited resources from somatic growth and maintenance. This diversion of resources in mated animals, often called a cost of reproduction, is usually expressed as a reduction of lifespan in mated animals, although some debate exists on the best way to measure this cost. I report here that in the soil nematode, Caenorhabditis elegans, sex significantly decreases male lifespan without reducing hermaphrodite lifespan. The reduction of mated male lifespan seems to be caused by additional sperm production and not by the physical activity of mating. This conclusion is supported by observations that a mutation reducing sperm production increased mean lifespan by about 65% in both mated males and hermaphrodites. This suggests that spermatogenesis, rather than oogenesis or the physical act of mating, is a major factor reducing lifespan in C. elegans. This contradicts the traditional biological assumption that large oocytes are much costlier to produce than small sperm.