牛病毒性腹泻病毒GSTZ株E1基因原核表达载体的构建及表达

为研究牛病毒性腹泻病毒的囊膜糖蛋白E1的抗原性,参考了Oregon C24V BVDV毒株的基因组序列(AF091605.1),并设计一对特异引物(上游引物5’-CCC GGA TCC ATG GCC TCT CCC TAC TGT-3’,下游引物5’-GGG CTC GAG TTA CCC TTG TGC TCC TGT T-3’),利用RT-PCR从病毒基因组中扩增E1基因609 bp全长片段,测序结果表明,与C24V株核苷酸同源性达100%.扩增产物经BamHI和XhoI双酶切,亚克隆至原核表达载体,双酶切鉴定表明成功构建了重组表达载体pET-32a(+)-E1.重组表达载体转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导表达,经SDSPAGE和Western-blot检测,成功诱导表达出25ku E1蛋白.实验结果为进一步研究BVDVE1蛋白的功能提供了参考.     

EB病毒核抗原1羧基端原核表达产物的纯化方法

EB病毒核抗原1羧基端的原核表达产物以包涵体和可溶性两种形式存在,用镍离子亲和柱分别对其进行了纯化.结果显示,可溶性部分以及经2M尿素溶解后的包涵体的最适咪唑洗脱浓度均为150mM.纯化后重组蛋白的纯度在90%以上.     

鳜IL-1β基因的克隆及原核表达

用RACE PCR获得了鳜白介素-1β(IL-1β)的全长cDNA.鳜IL-1β的cDNA全长为1298 nt(核苷酸),其5′非编码区包含UTR 93 nt;3′非编码区包含452 nt;其开放阅读框内包含753 nt,翻译成251个氨基酸.将鳜IL-1β克隆到原核表达载体pET-32a上,在大肠杆菌Rosettagami(DE3)内以包涵体形式得以高效表达.     

BVDV-2 E2基因的原核表达及重组蛋白反应原性的研究

为了对BVDV进行诊断,根据GenBank登录的BVDV-2 E2基因序列,设计特异性引物,对BVDV-2新疆分离株SWE2基因进行扩增,克隆入T载体中测序,然后亚克隆入BL21（DE3）表达载体pET-28a中,构建重组表达载体pET-28a-E2,并转化人大肠埃希氏菌中。用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Westernblot分析表达产物。SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为32ku;Westernblot分析表明该重组蛋白可与BVDV-2多克隆抗体发生特异性血清学反应,证实表达的重组E2蛋白具有良好的反应原性,为BVDV-2诊断试剂研发奠定基础。     

鳜IL-1β基因的克隆及原核表达

用RACE PCR获得了鳜白介素-1β（IL-1β）的全长cDNA．鳜IL-1β的cDNA全长为1298nt（核苷酸），其5′ 非编码区包含UTR 93nt；3′非编码区包含452nt； 其开放阅读框内包含753nt，翻译成251个氨基酸．将鳜IL-1β克隆到原核表达载体pET32a上，在大肠杆菌Rosettagami（DE3）内以包涵体形式得以高效表达．     

水稻基因ST1的克隆及原核表达

指出了基因ST1是决定水稻柱头和花柱形成的关键基因,属于水稻中的XHS基因家族.将ST1的全长cDNA序列构建到原核表达载体pET-28a中,并转化了表达菌株大肠杆菌BL21.经Western bolt验证表明:所表达80 kD蛋白即为目的蛋白,为后续的蛋白功能等研究提供了实验基础.     

根癌土壤农杆菌Ti质粒毒蛋白基因VirD1的克隆及原核表达

根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1蛋白表现拓扑异构酶活性,能解除T-DNA边界处25bp重复序列的超螺旋状态,使外源基因的插入成为可能.本实验以C58菌株为模板,设计了一对含有BamHI和XhoI酶切位点的引物,成功克隆了VirD1基因,并构建了原核表达载体pET30a-VirD1,将其在宿主菌BL21中获得了表达,为将来构建含有VirD1基因的植物表达载体并协助目的基因转化奠定基础.     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及原核表达

克隆、表达和纯化禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为筛选与NS1相互作用的宿主蛋白以及深入研究NS1蛋白的功能打下基础.根据GenBank中收录的H5N1亚型禽流感病毒NS1基因序列,设计并合成一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增AIV NS1基因,将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体pET-28a载体上,经酶切分析及序列测定正确后,鉴定出NS1基因的阳性重组子.阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用1 mmol/L IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE检测,获得预期蛋白的表达,通过Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对NS1蛋白进行纯化.结果成功克隆H5N1亚型AIV的NSl基因,其核苷酸序列长度为678 bp,重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量与预计大小一致,表达产物在上清及包涵体中均有表达.经纯化,目的蛋白纯度高达90%,成功表达纯化出28KD的NS1融合蛋白并鉴定其免疫学活性.成功克隆和表达了禽流感病毒H5N1 NS1基因序列,为进一步研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础.     

汉滩病毒M,S基因不同拼接方式原核表达效果比较研究

为了比较汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白(NP)主要抗原位点片段不同拼接方式的原核表达效果，将汉滩病毒76—118株M基因编码G1的片段与S基因编码区5’端约O．7kb的片段连接，克隆入pGEX一4T2，构建嵌合基因原核表达栽体pGEX-4T2-G1S0．7，pGEX-4T2-S0．7G1，在大肠杆菌XLl一Blue中诱导表达GST—G1S0．7或GST—S0．7G1融合蛋白。经IPTG诱导后，ELISA活性测定结果表明，两种融合蛋白均可与抗汉坦病毒NP的mAb特异性结合，融合蛋白GST—G1S0．7还可与抗汉滩病毒糖蛋白的mAb特异性结合。Western blot结果显示，诱导出G1S0．7或S0．7G1与GST的融合蛋白，其中G1S0．7嵌合基因的表达产物降解较少。研究证明：两种拼接方式的嵌合基因均可在大肠杆菌中表达出有生物学活性的融合蛋白，但表达效果不同，为汉滩病毒基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因及片段的原核表达

目的表达猪圆环病毒2型ORF2抗原,为研制猪圆环病毒2型血清学诊断方法以及生物制品生物安全性检验,提供技术支持。方法根据猪圆环病毒2型(PCV2)LC株序列,设计合成5对引物,采用PCR方法从全序列重组质粒PCV2-LC中扩增出了ORF2基因和4个不同ORF2基因片段,分别将其克隆到原核表达载体PET-32a上,再分别将各个重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21中,用终浓度1 mmol/LIPTG诱导。结果表达产物以包涵体的形式存在,经Western-blot检测表明,表达的重组蛋白ORF2b、ORF2c、ORF2d能够被PCV2阳性血清所识别,具有良好的抗原性。表达的重组蛋白为ELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

甲/戊型肝炎病毒重组抗原基因的克隆及表达

 将甲肝病毒vp1编码基因(aa 24~171)和戊型肝炎病毒ORF2基因(aa 431~615)通过一段编码柔性甘氨酸链(Gly4 Ser Gly4)的基因片断连接,获得编码HAV/HEV融合蛋白基因(AEAg342).将该融合基因插入质粒pBV220,构建表达质粒pBV220-AEAg342.将pBV220-AEAg342转化入大肠杆菌BL21中进行表达,表达量约占菌体总量的20%,经离子交换层析纯化,目的蛋白纯度达90%以上.Western blot证实该蛋白能与甲肝及戊肝患者阳性血清发生特异性反映,为进一步开发双价疫苗和联合诊断试剂奠定了一定基础.     

汉滩病毒囊膜糖蛋白g2基因重组腺病毒的构建与表达

获得汉滩病毒G2 基因 ,构建其重组腺病毒并在HEK2 93细胞中包装表达 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础。设计引物采用PCR从含汉滩病毒 \|76 1 1 8株M基因的M5 6质粒扩增出糖蛋白G2 基因片段 ,并将其克隆入腺病毒载体Adeno XviralDNA ,筛选获得重组腺病毒DNA ,转染HEK2 93细胞 ,包装、扩增后得到汉滩病毒G2 基因重组腺病毒原种 ;并在感染细胞内初步表达 ,用ELISA检测表达产物。得到了含汉滩病毒G2 基因的重组腺病毒 ,其滴度约为 1 0 10 pfu/mL ,同时在感染的HEK2 93细胞中检测到汉滩病毒糖蛋白G2 的表达。含汉滩病毒糖蛋白G2 基因重组腺病毒的成功构建 ,为研究汉滩病毒基因疫苗提供了实验基础     

Cloning, sequencing and expression of the coat protein gene of Cocksfoot mottle virus

The coat protein (CP) gene of Cocksfoot mottle virus (CfMV) was amplified by RT-PCR and inserted into expression vector pGEX-4T-1, and the resulting plasmid was designated as pGEXCfMV-JANCP. The fusion protein GST-CP was expressed in BL21 (DE3) pLysS after IPTG induction. The results of SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the CfMV-CP gene was efficiently expressed in E.coli BL21 (DE3) pLysS through IPTG induction and the 56.0 kD protein was obtained.     

Cloning, sequencing and expression of the coat protein gene of Cocksfoot mottle virus

The coat protein (CP) gene of Cocksfoot mottle virus (CfMV) was amplified by RT-PCR and inserted into expression vector pGEX-4T-1, and the resulting plasmid was designated as pGEXCfMV-JANCP. The fusion protein GST-CP was expressed in BL21 (DE3) pLysS after IPTG induction. The results of SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the CfMV-CP gene was efficiently expressed in E. coli BL21 (DE3) pLysS through IPTG induction and the 56.0 kD protein was obtained.     

戊型肝炎病毒开读框架(ORF2)1.3 kb片断巴斯德毕毕赤酵母表达载体的构建

戊型肝炎病毒（HEV）基因组为单链正股RNA，整个基因组有3个开放性阅读框架（ORFs），ORF2是主要结构基因编码区，将HEVORF21．3kb基因与分泌性表达质粒pHIL-S1和pPIC9重组，构成受酶离氧化酶（AOXI）的启动子与转录终止区控制的酶母表达质粒，酶切线性化后转化GS115酶母菌，经表型筛型选，PCR扩增筛选阳性克隆，以甲醇诱导表达。     

布鲁菌保护性抗原基因植物表达载体的构建

根据genbank序列,参照植物偏性密码子,设计合成适合植物表达的布鲁菌rplL基因和omp31基因。将携带植物表达优化序列的rplL基因片段与pBI-121载体相连接构建重组植物表达载体pBI121-rplL;将omp31基因与相应酶切并携带植物表达特征序列的pMD19-T6载体连接获得重组质粒,之后酶切获得携带植物表达优化序列的omp31基因片段,将其克隆入pBI-121载体,从而构建出带有不同目的片段的重组植物表达载体,为下一步检测基因在植物中的表达奠定基础。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆与表达

 根据已知H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因序列设计、合成克隆引物.自灭活的云南地方H5N1亚型病毒阳性临床组织样品中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(Pyobest^TMDNA Polymerase)扩增HA基因,采用Invitrogen定向表达系统(Champion^TMpET directional TOPO expression system)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组HA,分子质量约78ku.采用阳性血清经免疫印迹及ELISA分析重组HA的免疫反应性,结果表明重组HA能与H5N1亚型病毒抗血清发生特异性结合,具有良好的免疫反应性.     

Expression of E1 gene of a hepatitis C virus inE. coli and protein purification

The cDNA containing full encoding region of E1 antigen of HCV was cloned into an expression plasmid pRSETHisB. The recombinant plasmid pRSETE1 was introduced into the BL21 (DE3) strain ofE. coli. The engineering bacteria harbouring the pRSETE1 was cultivated in 2YT medium at 37°C. When the Expression of E1 protein was induced by 1 mmol IPTG, the bacteria was killed and the number of living cell was droped down from 10⁷ to 10³ cell/mL one hour post induction. Suggest that E1 protein is poisoned toE. coli. However, the 26kD polypeptide of E1 fussion protein still synthesized in appropriate condition. The expression level was about 10% of total protein 4 h after inducing. The E1 protin was purified by Ni²⁺-NTA-Agarose column chromatography to homogeneous. The purified E1 protein was sensitive and specific in reaction with anti-HCV antibody in sera. Supported by the Science Committec of Hubei Province Ye Linbai: born in Feb. 1948. Professor     

禽流感病毒H5亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法的研究

 在获得禽流感病毒多克隆抗体及H5亚型特异性单克隆抗体的基础上,研究建立H5亚型特异性抗原捕捉ELISA检测方法,用于检测H5亚型禽流感病毒.优化反应条件,确定包被抗体、检测抗体及酶结合物的最佳工作浓度,进行敏感性、特异性、重复性及稳定性分析,并与RT-PCR方法比较.同时使用该方法对野外样品进行检测.结果表明:该方法敏感、特异,具有良好的重复性和稳定性,可用于检测临床样品、鸡胚培养物及细胞培养物中的H5亚型禽流感病毒.