转铁蛋白-阿霉素复合物与HepG2细胞的作用机制

利用转铁蛋白受体介导的内吞作用,使转铁蛋白-阿霉素复合物(Tf-DOX)靶向作用于肿瘤细胞具有深远意义.文章利用荧光光谱确定了阿霉素对转铁蛋白具有荧光猝灭作用,且为静态猝灭.利用激光共聚焦显微镜观察到Tf-DOX可以靶向进入活的人肝癌细胞(HepG2)内,且5h时位于细胞质,24h时DOX解离进入细胞核.而同样条件,单独阿霉素5h已进入细胞核.利用流式细胞仪法检测了Tf-DOX进入细胞的转运机理,结果表明Tf-DOX是通过网格蛋白(Clathrin)介导、转铁蛋白受体决定的内吞机制进入细胞,具有温度、能量依赖性.体外培养条件下,利用MTT比色法检测Tf-DOX对HepG2细胞活力的影响,结果表明转铁蛋白-阿霉素体系保持较好的活性,相对单独阿霉素对细胞的杀伤力较强.这些结果表明转铁蛋白-阿霉素复合物具有明显的生物效应和潜在的生物医药价值.     

原儿茶酸对Huh7细胞中HNF1α表达的抑制影响

研究原儿茶酸(0,0.1,1,10μg/m L)处理Huh7细胞24 h和48 h对肝细胞核因子1α(HNF1α)表达的影响.荧光定量PCR和蛋白印迹检测结果表明,原儿茶酸不仅能抑制Huh7细胞中HNF1α的mRNA表达水平,也能抑制Huh7细胞中HNF1α的蛋白表达水平.由于HNF1α可以调控乙肝病毒的S1和C启动子活性,本研究结果提示,原儿茶酸可能通过抑制肝细胞HNF1α的表达而发挥抗HBV作用.     

基于细胞的β2肾上腺素能受体激动剂功能性筛选体系在中草药中的应用

为了建立基于细胞的β2肾上腺素能受体激动剂筛选体系,将大鼠β2受体基因克隆人pcDNA3.1载体.转染具有cAMP应答元件调控的绿色荧光蛋白报告基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO),从得到的阳性单克隆细胞中筛选得到一个稳定表达β2受体,并且在受到激动剂刺激后发出剂量依赖绿色荧光强度的细胞株.将此筛选体系用于从中药中筛选具有β2受体激动剂活性的化合物.从几种芸香科药材中得到了辛弗林(synephine),从细辛和附子中得到了去甲乌药碱(higenamine),首次从受体水平证明了它们的β2激动剂活性.此筛选体系适合从大量天然化合物中快速筛选具有β2激动剂活性的成分.     

积雪草苷调控miR-342-5p/AQP3轴保护IL-1β诱导的软骨细胞损伤

目的 探讨积雪草昔(Ass)对白细胞介素1B(IL-1B)诱导的软骨细胞损伤的影响及作用机制。方法 不同 浓度的Ass作用IL-1B诱导软骨细胞24 h,流式细胞仪检测细胞凋亡,酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液中白细 胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,实时荧光定量PCR检测细胞中miR-342-5p和水通道蛋白3 (AQP3)mRNA表达水平,Western Blot法检测B淋巴细胞瘤-2 (Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)和AQP3蛋 白表达水平。双荧光素酶报告基因实验验证miR-342-5p与AQP3靶向关系。转染miR-342-5p抑制剂或AQP3过表达载体至软骨细胞,上述相同方法检测抑制miR-342-5p表达或AQP3过表达对IL-1β诱导的软骨细胞凋亡及IL- 6和TNF-α表达的影响。结果 Ass可抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡率、Bax蛋白、IL-6和TNF-α表达及miR- 342-5p表达(P <0. 05),促进Bcl-2蛋白、AQP3 mRNA和蛋白表达(P <0.05)。miR-342-5p在软骨细胞中负调控 AQP3表达。抑制miR-342-5p或AQP3过表达后,IL-1&诱导的软骨细胞凋亡率、Bax蛋白、IL-6和TNF-α表达降低 (P <0. 05) ,Bcl-2蛋白表达升高(P <0.05)。抑制AQP3表达逆转了抑制miR-342-5p对IL-1β诱导的软骨细胞凋 亡、Bax和Bcl-2蛋白及IL-6和TNF-α表达的影响。结论 Ass可抑制IL-1β诱导软骨细胞凋亡和炎症反应,其可 能通过调控miR-342-5p/AQP3保护软骨细胞损伤。     

肝X受体α在小胶质细胞激活致神经元损伤中的作用研究

[目的]研究肝X受体alpha(LXRα)在小胶质细胞激活致神经元损伤中的作用.[方法]小鼠小胶质细胞株(BV2细胞)置于6孔培养板培养,分为对照组、Aβ组、干扰组、干扰+Aβ组、假干扰+Aβ组.应用倒置显微镜观察各组BV2细胞的形态学变化,Western blot方法检测LXRα蛋白表达变化,ELISA检测各组上清液中COX-2、iNOS的表达水平.收取BV2细胞上清液作为条件培养基用来培养人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞),并通过CCK-8和免疫荧光法检测SH-SY5Y细胞的存活率和凋亡蛋白Bax表达情况.[结果]与对照组相比,Aβ组及干扰组的BV2细胞表现为胞体变圆变大,细胞突起减少,呈阿米巴样活化状态,LXRα蛋白水平明显下调(P0.05),细胞上清液COX-2,iNOS的表达含量明显升高(P0.05),Aβ处理组和干扰组的细胞上清液明显引起SH-SY5Y细胞存活率降低、凋亡蛋白Bax表达增加(P0.05).与假干扰+Aβ组相比,干扰+Aβ组的细胞胞体变大,突起减少,LXRα蛋白表达减少,COX-2,iNOS的表达增加,干扰+Aβ组的细胞上清液导致SH-SY5Y细胞存活率降低,Bax表达增加(P0.05).[结论] LXRα参与调控Aβ诱导的小胶质细胞激活及炎症因子的释放,在AD的炎症机制中发挥重要作用.     

RT-PCR法检测SMMC-7721人肝癌细胞α5 β1整合蛋白mRNA的表达

整合蛋白α5β1是一类存在于细胞表面的细胞粘附分子,在肝癌的发生发展和演进中起着重要的作用.研究了快速定量检测整合蛋白α5β1mRNA表达的RT-PCR方法,结果表明在PCR反应体系中加入25ng到200ngmRNA的逆转录产物呈较好的线性关系,并以此为反应条件测定pcDNA3-α5,pcDNA3-β1质粒共转染或单转染的α5β1.6-7721,α5.3-7721,β1.6-7721细胞株mRNA的表达,表明经pcDNA3-α5,pcDNA3-β1质粒感染后人肝癌细胞株SMMC7721细胞中整合蛋白α5β1的表达有较大幅度的提高,而且α5,β1亚基间可能存在相互的诱导作用.     

绿色荧光蛋白α2b-干扰素融合蛋白的表达与活性研究

采用基因重组技术,构建原核表达质粒pET 32a( )/GFP-α2b-IFN,转化大肠杆菌BL 21,以IPTG诱导融合蛋白的表达并用镍金属螯合层析柱进行纯化.SDS-PAGE及免疫印迹结果显示,46.0 kD的融合蛋白在大肠杆菌中得到了正确的表达,并具有α2b-IFN的抗原活性.受体结合实验表明,该融合蛋白能够与W ISH细胞上的干扰素受体特异性结合,并在激发光下呈亮绿色荧光.采用细胞病变法测定分离纯化的融合蛋白的抗病毒活性,比活力为1.0×107IU/m g.表达的GFP-α2b-IFN融合蛋白具有α2b-IFN的特性与荧光活性,为研究α2b-IFN受体功能以及IFN与细胞相互作用的机理奠定了基础.     

植物内生真菌来源的倍半萜对LPS诱导细胞炎症反应的抑制作用

目的:探究马铃薯内生真菌次生代谢产物中新型倍半萜类化合物TA的抗炎作用.方法:脂多糖(LPS)刺激RAW264.7细胞建立体外炎症模型,通过测定细胞存活率、细胞NO的产生量、细胞内活性氧(ROS)水平,细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)的释放量、一氧化氮合成酶(iNOS),环氧合酶(COX-2)蛋白表达量,从而评价化合物TA的抗炎活性.结果:化合物TA对细胞无毒性,可剂量依赖性地抑制LPS刺激产生的NO,降低ROS水平,减少细胞炎症因子TNF-α和IL-1β的产生及下调iNOS,COX-2蛋白的表达量.结论:马铃薯内生真菌次生代谢产物中新型倍半萜类化合物TA具有显著的抗炎活性.     

MEK5α和MEK5β调控Beclin 1启动子

Beclin 1是哺乳动物自噬相关基因,调控自噬起始和自噬体成熟.在肌肉分化过程中,Beclin 1基因表达上调,自噬增加;此外MEK5-ERK5信号活化并调控成肌细胞分化.因此,在肌肉分化过程中,MEK5-ERK5信号通路可能调控Beclin 1基因表达.目的是阐明MEK5对成肌细胞Beclin 1基因启动子活性的调控.将不同长度Beclin 1启动子片段克隆至荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic并转染成肌细胞C2C12.双荧光素酶报告基因检测实验结果显示,含Beclin 1基因起始密码子上游586碱基对DNA片段的载体(p-354)具有强荧光素酶活性.MEK5α显著增加p-354荧光素酶活性,并有剂量依赖性;而MEK5β显著降低p-354荧光素酶活性.MEK5β能够拮抗MEK5α对p-354荧光素酶活性的调控.与MEK5对Beclin 1基因启动子调控结果一致,MEK5αCA上调细胞Beclin 1 mRNA表达,MEK5βDD下调Beclin 1mRNA表达,并且MEK5βDD抑制MEK5αCA对Beclin 1 mRNA表达的促进作用.此外,转录因子CREB家族成员CREB3,CREBP和CREBL1能够显著上调p-354荧光素酶活性.CREB3呈剂量依赖性显著上调p-354荧光素酶活性,并与MEK5α具有协同效应.MEK5α和MEK5β对Beclin 1启动子具有不同调控作用,CREB可能是其下游效应因子.     

人白介素-3乳腺表达载体的构建

人白介素-3是一种造血系统和免疫系统调节剂,在治疗造血系统疾病、肿瘤、先天或获得性免疫功能缺陷等方面发挥着重要作用.应用牛乳腺生物反应器生产人白介素-3的研究具有重要的临床应用和经济价值.研究选用具有红色荧光蛋白报告基因(R ed2)和新霉素抗性基因(neor)表达框架的pD sR ed2-1质粒为骨架构建人白介素-3乳腺表达载体.通过PCR方法分别扩增牛β-酪蛋白基因5′端上游调控序列、人IL-3基因以及CM V启动子序列,将它们按先后顺序分别定向克隆于质粒pD sR ed2-1的多克隆位点内,使牛β-酪蛋白基因调控序列位于人IL-3基因的上游,指导人IL-3基因在乳腺组织中特异性表达,而CM V启动子位于红荧光蛋白基因的上游,指导红荧光蛋白基因在所有的组织中非特异性表达.限制性酶切片段分析及部分DNA序列鉴定结果表明,所构建载体结构正确.     

包囊游仆虫包囊形成和解脱过程中微管蛋白基因表达的变化

采用干涉相差显微术和实时荧光定量PCR(Q-PCR)技术显示,腹毛类纤毛虫包囊游仆虫(Euplotes encysticus)包囊形成和解脱过程中,细胞微管胞器始终处于非装配及装配的功能活动状态,脱包囊过程中伸缩泡的运动对细胞充分吸水用于微管胞器的再装配及细胞运动起了关键的作用,细胞内α-、β-和γ-微管蛋白基因的表达量相伴发生变化.其中,微管胞器去分化时,细胞形成毛基体非吸收型包囊,细胞α-、β-和γ-微管蛋白基因的表达量整体呈现逐渐减少的趋势,其细胞微管蛋白基因的相对表达量从大到小依次是β-、α-和γ-微管蛋白基因,但α-、β-微管蛋白基因的起始拷贝数远大于后一种微管蛋白基因的表达量;微管胞器再分化时,伴随着伸缩泡的剧烈伸缩运动,口纤毛器和体纤毛器微管先后形成,细胞在包囊内做旋转运动并脱囊而出,迅速转化为营养细胞,期间细胞内α-、β-和γ-微管蛋白基因的表达量呈现从小到大增加的趋势,其微管蛋白基因的相对表达量从大到小依次是β-、α-和γ-微管蛋白基因,而前两种微管蛋白基因的起始拷贝数远大于后一种微管蛋白基因的表达量.结果表明,包囊游仆虫形成包囊和脱包囊过程中,伴随着皮层微管胞器的不同分化,细胞内α-、β-和γ-微管蛋白基因始终处于不同的功能活动状态,其中作为微管组织中心主要组分的γ-微管蛋白也始终处于不同的功能状态.     

在Huh7细胞中原儿茶酸对肝细胞核因子(3α/3β/4α)的影响

研究在Huh7细胞中原儿茶酸对肝细胞核因子(3α/3β/4α)的影响,通过荧光定量PCR和蛋白印迹的方法检测,结果显示原儿茶酸不仅能抑制Huh7细胞中肝细胞核因子(3α/3β/4α)的m RNA水平,还能抑制肝细胞核因子4α的蛋白水平,综上所述原儿茶酸能够抑制Huh7细胞中肝细胞核因子(3α/3β/4α)的表达.1     

中国流行株HIV—1gp120及其与IFNα基因共表达核酸疫苗质粒的构建及表达

目的 研究pGP和pGPIFNα在真核细胞中的表达。方法 以表达中国流行株HIV－1gp120基因的核酸疫苗质粒pGP及其表达中国流行株HIV－1gp120基因与IFNα基因与IFNα基因的核酸疫苗质粒pGPIFNα。转染BHK－21细胞，以间接免疫荧光鉴定其表达产物。结果 荧光显微镜下，pGP和pGPIFNα转染细胞可见绿色荧光，而HK－21细胞和空质粒则不见绿色荧光。结论 pGP和pGPIFNα可在真核细胞中表达目的蛋白gp120。     

甘草酸18位差向异构体不同配比和浓度对Caco-2细胞P-gp功能的影响

研究甘草酸18位差向异构体18α-甘草酸(18α-Gly)与18β-甘草酸(18β-Gly)不同配比和浓度对结肠癌(Caco-2)细胞P-糖蛋白(P-gp)功能的影响,选择最佳浓度比例.建立细胞模型,选择甘草酸总浓度为1∶10∶30∶60∶120∶240 μmol/L,18α-Gly与18β-Gly物质的量比分别为10∶0、8∶2、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8、0∶10,根据细胞存活率,选择合适浓度比例,利用流式细胞仪测定细胞内荧光强度,寻找荧光强度最大的浓度比,即对P-gp抑制作用最强,P-gp功能最弱.研究结果表明甘草酸总浓度为1 μmol/L时,随着18α-Gly比例的减少,荧光强度逐渐减弱,P-gp诱导作用逐渐增加.甘草酸总浓度为10 μmol/L和60 μmol/L时,随着两者物质的量比的变化,荧光强度变化明显;当总浓度为10 μmol/L,n(18α-Gly)∶n(18β-Gly)=4∶6时,荧光强度较强,抑制作用明显;当总浓度为60 μmol/L,两者物质的量比为5∶5时荧光强度最强,抑制作用最强.     

岗松总黄酮对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症的影响

为探讨岗松总黄酮（GSH）的抗炎活性机制,通过NF-κB信号通路,研究脂多糖（LPS）诱导RAW264.7细胞炎症的保护作用。实验采用噻唑蓝（MTT）法检测GSH对RAW264.7细胞增殖活性的影响,采用酶联免疫法（ELISA）检测GSH对白介素（IL-1β、IL-8）及转换生长因子β （TGF-β）的影响,采用蛋白印迹法（WB）检测细胞中IκBα蛋白相对表达,采用实时定量基因扩增荧光检测法（QPCR）检测细胞中NF-κB p65的mRNA基因表达。研究结果表明, GSH处理细胞后,可促进RAW264.7细胞增殖（P<0.05）,抑制IL-1β、IL-8、TGF-β含量（P<0.01）,上调IκBα蛋白的相对表达（P<0.05或P<0.01）,抑制NF-κB p65的mRNA基因表达（P<0.01）。推测岗松总黄酮抑制NF-κB信号通路可能是其抗炎活性作用机制之一。     

山慈菇正丁醇提取物对NR8383细胞分泌的IL-1β和TNF-α水平的影响

为了探讨山慈菇正丁醇提取物对NR8383细胞(大鼠肺泡巨噬细胞)分泌的白介素-1β(interleukin-1,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平的影响,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)法检测TNF-α和IL-1β的mRNA水平,利用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测细胞上清液中TNF-α和IL-1β的蛋白含量。结果显示:与空白对照组相比,终浓度1. 25 mg/m L的山慈菇正丁醇提取物可极显著降低R8383细胞分泌TNF-αmRNA水平和蛋白含量(P 0. 01);与空白对照组相比,终浓度1. 25 mg/m L山慈菇正丁醇提取物能极显著升高IL-1β的mRNA水平和蛋白含量(P 0. 01),同时0. 012 5 mg/m L山慈菇正丁醇提取物能极显著降低IL-1β的mRNA水平和蛋白含量(P 0. 01)。说明终浓度为1. 25 mg/m L的山慈菇正丁醇提取物可极显著调控NR8383细胞分泌的TNF-α和IL-1β的基因和蛋白含量。     

Rac1突变重组体的构建及对JAK/STAT信号通路的影响

通过构建Rac1突变体，研究Rac1激活对肾小球系膜细胞(MES)JAK2/STAT3信号通路的影响.以Rac1目的基因为模板，在引物中设计突变，扩增突变体Rac1(G12V)的目的基因，与PiggyBac(PB-FLAG)载体质粒连接，构建突变重组体PB-Rac1(G12V),并运用脂质体核酸试剂转染系膜细胞.比较正常组、Rac1(G12V)突变组中系膜细胞的ROS含量及NADPH氧化酶活性；Elisa法检测细胞因子TGF-β表达水平；Western blot法检测系膜细胞中JAK2/STAT3信号及FN蛋白的表达.结果表明，成功构建了Rac1(G12V)持续磷酸化突变体并在MES细胞中表达，与正常组相比，Rac1(G12V)激活突变MES细胞NADPH氧化酶的活性和ROS含量明显增加；JAK2/STAT3信号通路激活，TGF-β和FN表达明显增加.Rac1能激活系膜细胞氧化应激和JAK2/STAT3信号通路，并促进TGF-β及FN的表达.     

姜黄素与阿霉素联合应用抗肿瘤的协同作用

研究姜黄素与阿霉素联合应用对人纤维肉瘤HT1080、人乳腺癌MCF-7、人肺癌A549细胞的增殖抑制作用及诱导肿瘤细胞凋亡的协同作用,探讨其抗肿瘤协同作用的机制,为临床寻找有效的化疗增敏剂提供实验依据和理论基础.MTT法测定细胞增殖抑制率,结果表明5μmol/L姜黄素与阿霉素联合用药对HT1080、MCF-7、A549细胞均表现出协同抗肿瘤作用;Hoechst 33258荧光染色观察A549细胞凋亡的形态学变化;Westernblot法检测A549细胞bcl-2蛋白的表达,结果表明姜黄素与阿霉素联合应用可显著诱导A549细胞发生凋亡,其协同抗肿瘤的机制可能与下调抑凋亡蛋白bcl-2表达有关.     

人源Krt5促进斑马鱼成纤维细胞丝状伪足形成和伤口愈合

目的:探究斑马鱼角蛋白Krt5和M1/M2型巨噬细胞极化因子调节斑马鱼下颌和心脏芽基可塑性再生过程的机制。方法:在斑马鱼胚胎成纤维细胞PAC2中过表达人源Krt5,添加4个代表性的巨噬细胞极化因子蛋白。在检测蛋白表达情况后，免疫荧光法观察Krt5和F-actin在PAC2细胞的分布变化；细胞划痕实验检测PAC2细胞迁移能力；转录组测序和免疫沉淀-质谱(IP-MS)分析Krt5调控网络。结果:Krt5围绕着细胞核，在胞浆成束成网分布并扩展到细胞质膜；过表达Krt5增加鬼笔环肽标记的F-actin代表的细胞丝状伪足形成，并加快细胞迁移愈合；转录组分析显示，Krt5明显增加Rac2/Rhov、NF-κB、Mylkb、Ifnphi1、IL-13和IL-11的转录，降低多个胶原蛋白、肌动蛋白和TGF-β家族基因转录，同时IL-1β、IL-4、IL-6和IL-10诱导处理总体上与Krt5作用一致；IP-MS证实Krt5与α-辅肌动蛋白(Actn1)和非肌肉肌球蛋白重链(Myh9b, Myh10)紧密结合。结论:Krt5可能通过与肌动蛋白相互作用激活Rac/Rho机制从而促进细胞生成丝状伪足，重塑细...     

TAT-Apoptin蛋白制备及其诱导BGC-823细胞的凋亡作用

为了制备单一组分TAT-Apoptin融合蛋白,检测其跨膜及凋亡活性.利用IPTG诱导目的质粒p GEX-6p-1-TAT-Apoptipn及对照质粒p GEX-6p-1-TAT-EGFP和p GEX-6p-1-TAT-Apoptin-EGFP可溶性表达,纯化蛋白并孵育BGC-823细胞,荧光显微镜、DNA ladder、流式细胞术检测融合蛋白跨膜及凋亡活性.结果表明,成功诱导融合蛋白表达,获得单一蛋白,荧光显微镜检测TAT将融合蛋白带入细胞内且不影响其活性,TAT-Apoptin融合蛋白处理BGC-823细胞36和48 h时后出现典型DNA Ladder条带,流式细胞术检测早期凋亡率48 h为61.5%,在24~48 h范围内凋亡率增加.结论为制备的TAT-Apoptin蛋白可跨膜诱导BGC-823细胞凋亡,且具有较高活性.