人气管普孢子虫基因组中MITEs转座子的鉴定及进化分析

利用生物信息学方法,首次在人气管普孢子虫( Trachipleistophorahominis )基因组内鉴定到 9 个 MITEs 家族ThME1~ThME9 ,共 123 个拷贝, MITEs 转座子的长度均小于 600bp 。根据靶位点重复序列( Targetsiteduplication ,TSD )的不同,将 ThME1 归 属 于 Tc1 / Mariner 超 家 族, ThME2 和 ThME3 归 属 于 PIF / Harbinger 超 家 族, ThME5 和ThME6 归属于 CACTA 超家族(超家族的名字用正体较好,下同),其余家族归为新家族。分析发现,人气管普孢子虫中的所有 MITEs 家族的吉布斯自由能均小于 0 ,表明 MITEs 家族具有形成二级结构的潜能,有利于该家族在基因组上转座。人气管普孢子虫 MITEs 家族在基因组的插入时间估计在 0~800 万年内,而且这种插入在基因组中是随机的,没有位置偏向性,并发现 2 个 MITEs 转座子拷贝插入到基因编码区内部。上述结果为进一步研究微孢子虫 MITEs 转座子的起源以及功能奠定了基础。
     

枣树全基因组MITEs成分分析与系统进化研究

微型反向重复转座基因(minialure inverted repeat transposable elements,MITEs)的演化可能是造成枣树基因组及品种多样性的重要原因.为研究MITEs在枣树全基因组中的分布、种类及演化,使用MITE预测软件(MITEDigger)识别枣树全基因组中的MITEs序列,在植物MITEs数据库中进行分类注释,并用MEGA 6.0构建枣树基因组中MITEs的系统进化树.结果显示,MITE-Digger检测出MITEs总共3 230条,碱基数为1 104 679 bp,占基因组比例为0.34%;其中共有948条在植物MITEs数据库中比对到相似序列,这些MITEs可以归类到5个家族:h AT,PIF/Harbinger,CACTA,Mutator和Tc1/Mariner,MITEs系统进化树显示:枣树基因组中MITEs来源于少数几个共同祖先,在长期的进化中有明显的扩增和突变,这可能与枣树品种多样性有关.研究结果将为枣树的遗传资源及育种研究提供重要参考.     

柞蚕微孢子虫基因组LTR反转座子鉴定与进化分析

【目的】鉴定柞蚕微孢子虫(Nosema pernyi)基因组中LTR反转座子的种类、数量和遗传关系。【方法】从GenBank数据库下载柞蚕微孢子虫基因组序列,采用MGEScan软件筛选潜在重复元件,通过NCBI-BLAST与不同物种的逆转酶进行比对,含有逆转录酶结构域的序列认定为LTR反转座子,并探讨它们的结构特征、所属类型和基因组分布特点。【结果】从柞蚕微孢子虫基因组中共发现6个LTR反转座子家族即Nar1,Nar2,Nar3,Nar4,Nar5和Nar6,长度在3～4kb之间;大部分家族有相似的LTR末端核苷酸,但靶位点重复和拷贝数存在差异;逆转录酶结构域系统进化树显示6个LTR反转座子家族均属于Ty3/Gypsy类型,且与家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)LTR反转座子形成姊妹分支;Nar2和Nar4家族在基因组上成串排列,具有相似的分布特征。【结论】柞蚕微孢子虫基因组中存在Ty3/Gypsy类型的LTR反转座元件,进化地位与家蚕微孢子虫最为接近;LTR反转座子家族重复元件在基因组上成串排列,可能是柞蚕微孢子虫基因组扩张的潜在因素之一。     

陆地棉LTR反转录转座子的数量分布与功能分析

LTR(Long terminal repeat)反转录转座子是真核生物基因组中普遍存在的一类遗传因子,它们以RNA为媒介在基因组中不断自我复制.在高等植物中,LTR反转录转座子是基因组的重要成分之一.本研究通过多种方法挖掘并注释了陆地棉基因组中的LTR反转录转座子,结果表明陆地棉基因组LTR反转录转座子的Gypsy超家族与基因的分布呈近似的反比关系,而Copia超家族在各染色体的起始端有较多的分布.通过皮尔森相关系数发现陆地棉LTR反转录转座子的拷贝数与染色体大小之间有强相关性.在LTR反转录转座子上游和下游分布的基因具有类似的富集特征,其分子功能主要集中在结合和催化活性等方面.本研究结果加深了对陆地棉LTR反转录转座子的认识,为深入研究棉花基因组提供了重要数据支撑.     

鲤科鱼类Angel 相关元件的鉴定及其系统发育意义

Angel相关元件属于微型反向重复转座元件(MITEs)的一个家族．我们在鲤科雅罗鱼系鱼类的生长激素基因内含子2序列中分离并鉴定了这类元件,而在鲃系的直系同源位点上没有发现,从而为雅罗鱼系的单系性提供了新证据．这类元件可能是在雅罗鱼系与鲃系分歧后插入到雅罗鱼系的共同祖先中的．较高的序列变异及相对广泛的物种分布表明生长激素基因中的Angel相关元件是一类古老的转座子,大约26 Ma前可能已经在雅罗鱼系共同祖先中出现．     

Tn7转座子在大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌及鳗弧菌中的应用

Tn7转座子是一种定点插入型转座子,固定地插在细菌的glmS基因下游的attTn7位点,而glmS基因与细胞壁的合成有关,存在于所有的细菌中,所以Tn7转座子可以插入到所有细菌的染色体,因此Tn7转座系统已被开发为细菌基因组改造的重要工具。为了方便对大肠杆菌、迟钝爱德华氏菌和鳗弧菌的改造和研究,探讨应用Tn7转座子对其基因组进行改造的操作步骤,并利用阿拉伯糖启动子pBAD诱导的Flp/FRT系统建立了高效、快捷的抗性消除方法。     

利用Tn5转座子构建杆状病毒AcMNPV随机突变体的初步研究

以杆状病毒模式种AcMNPV为研究对象,应用基于Tn5转座子的随机转座的方法,构建杆状病毒突变体库将果蝇hsp70启动子后接绿色荧光蛋白基因后插入Tn5转座子,构建了可以在昆虫细胞中表达,易于跟踪的转座载体．利用体外转座系统将转座子随机插入AcMNPV基因组,并用转座反应液转染Sf21细胞,得到了表达绿色荧光蛋白的病毒突变体库进一步纯化了两株病毒B9F和Li6A,进行了转座子插入位点的分析,确定两株病毒中,转座子分别插入了94K基因和p10基因．该方法将为杆状病毒功能基因组研究提供重要的手段。     

水稻白叶枯病菌致病相关基因筛选系统的建立

水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae是水稻生产中最严重的细菌性病害之一。本研究采用Tn5转座子随机插入突变的方法构建水稻白叶枯病菌广西菌株K74的突变体库,Southern杂交显示Tn5随机单拷贝插入基因组。通过水稻致病性检测试验,目前获得15个致病力降低50%以上的突变体,为定位Tn5插入突变基因,经质粒拯救、测序、序列分析后发现:4个突变基因为gum基因簇基因,5个为LPS基因簇基因,2个为metB基因,1个为hrpB1基因,2个是与糖合成转移酶相关基因,1个为编码假定蛋白的基因。其中14个突变基因是已知的与致病相关的基因。实验结果表明本研究成功建立了一个筛选水稻白叶枯病菌致病相关基因的系统,为进一步研究水稻白叶枯病致病相关基因,阐明该病的致病机理奠定基础。     

真菌中DNA重复序列诱导点突变的研究进展

1987年,由Selker等在粗糙脉孢菌中首次发现重复序列诱导点突变(repeat-induced point mutation,RIP).在重复序列诱导点突变过程中,搜寻前减数分裂组织单倍体核中DNA的重复序列,然后发生众多的碱基C到T的突变,产生富碱基T+A片段,从而使重复序列中的G-C碱基对发生转换突变成为A-T碱基对.此外,发生RIP的序列多集中在着丝粒区域,主要是转座子甲基化后的遗迹.移动转座子是真核生物基因组进化的主要驱动力.对于真菌,重复序列诱导点突变(RIP)在减数分裂过程中通过突变多拷贝DNA,能最大限度地减少转座子的影响,因此对RIP的研究在一定程度上能有助于了解基因组进化的真谛.综述了重复序列诱导点突变的产生机制,以及真菌中重复序列诱导点突变的研究进展.     

铜绿假单胞菌鞭毛运动相关基因的研究

建立优化的转化条件,将M u转座复合物电转化到临床分离的一株铜绿假单胞菌(P seud om onasaerug inosa)PA 68中,最高转化效率达3.66×104CFU/μg DNA.通过表型筛选,得到三株鞭毛运动能力缺陷的突变子,Sourn thern杂交证实转座子为单点插入.经基因克隆、核苷酸测序研究,证明转座子分别插入到uvrD、phzF 1、zw f三个基因中,这是首次在国际上将M u转座重组技术应用到鞭毛运动相关基因的研究中.由于人工M u转座技术具有随机单点插入的优点,克服了传统转座子能在染色体上迁移的缺点,为进一步研究P.aerug inosa的鞭毛运动机理及致病性奠定基础.     

奇蹄目核糖核酸酶基因超家族(RNASE A)的分子进化研究

为深入认识核糖核酸酶基因超家族(RNASE A),以奇蹄目的家马、驴、野马和白犀牛为研究对象,分析RNASE A序列、鉴定真假基因、预测等电点及构建系统发育树.结果揭示每个物种的RNASE A序列数并不相同,RNase4在该研究物种分歧之前发生1次基因复制,其中1个拷贝保留功能,另外1个拷贝发生假基因化并在不同物种中有不同程度的保留或丢失,而RNase2/3和RNase7/8经历"基因分拣"进化模式.另外,典型的RNASE A序列特征在RNase9—13中发生变异,揭示RNase9—13可能丢失核糖核酸酶活性而具有其他新功能.总之,该研究系统探讨了奇蹄目RNASE A的分子进化,增加了该基因超家族研究的多样性,为更加深入开展RNASE A研究提供了基础.     

PiggyBac 转座子在肝脏中的活性研究

本实验运用高压尾静脉注射的方法将PB转座系统导入小鼠肝脏,研究其在肝脏中的转座活性,系统中PB转座子携带表达红色荧光蛋白的基因以指示转座的发生.注射10个月后取出小鼠肝脏,体视荧光显微镜观察肝脏是否有红色荧光,并通过基因组PCR、splinkerette PCR分析PB转座子在肝脏中的插入情况.实验结果表明,PB转座子在肝脏内发生高效转座,检测的68个PB插入位点中有34个位于基因序列,使得PB系统可以作为有效的基因诱变工具来研究基因功能.     

响叶杨（杨属）叶绿体基因组测序与比较分析

本研究中,我们对响叶杨的叶绿体基因组进行测序和组装,并将其与杨属其他11个叶绿体基因组进行比较分析.结果表明,响叶杨叶绿体基因组全长158,591bp,其中两个反向重复序列区(IR)长度均为27,667bp,长单拷贝序列区(LSC)和短单拷贝序列区(SSC)长度分别为84,634和18,623bp.通过对杨属12个物种的叶绿体基因组进行比较,只发现了6个相对较大的插入缺失,因此整体而言,杨属的叶绿体基因组结构是高度保守的.系统发育分析结果显示,杨属中12个物种组成了3个具有高支持率的进化支,响叶杨与其他白杨组物种聚为一支,并且与银白杨的亲缘关系最近.本研究基于叶绿体基因组数据揭示了杨属的进化历史,将有助于进一步开展杨属植物基于叶绿体DNA序列数据的群体遗传学及其他分子生态学研究.     

不同拷贝数及间隔肽序列对毕赤酵母分泌表达EXA的影响

通过多拷贝串联表达,以及在分泌信号序列和目的蛋白N端之间插入几个氨基酸的间隔短肽,以提高exendin-4类似物串联体EXA在重组毕赤酵母中的分泌表达水平.实验结果表明:2～5个EXA串联插入均比单个EXA插入有利于提高表达水平,而4拷贝EXA串联体的表达产物较多滞留在胞内.在EXA的N端增加间隔肽可促进蛋白分泌,与不含间隔肽序列的4拷贝EXA串联表达载体相比,含有糖基化位点(NTTEEGEPK)和肠激酶识别位点(DDDDK)间隔肽的插入,使蛋白表达水平分别提高了4倍和9倍.     

FZD蛋白家族的起源与演化分析

FZD(Frizzled)蛋白家族是Wnt信号通路的跨膜受体,在动物发育过程中起着非常关键的作用.通过对不同物种(从单细胞动物到哺乳动物)基因组中FZD家族基因的检索,发现FZD蛋白家族起源于早期的、与海绵动物具有共同祖先的后生动物.进化分析结果表明,FZD蛋白家族分为4个亚家族:FZD1/2/3/4/6/7亚家族、FZD5/8亚家族、FZD4亚家族和FZD9/10亚家族;不同亚家族之间的motif组成不同,但在C端都含有一个保守的KTXXXW motif.进化速率分析结果表明,尽管FZD蛋白家族成员在演化过程中受到较强的纯化选择,但是在其基因发生复制或motif组成变化的分支上仍有正选择的作用.该结果可为进一步理解FZD蛋白家族的起源与演化动态提供一定的参考.     

Tn5转座子插入p95基因不影响AcMNPV的复制

从Tn5转座子介导的AcMNPV随机插入突变体库中,分离到一株复制正常的突变体AcApra41.突变定位发现Tn5转座子插入了病毒p95基因中.为了排除AcApra41中还有其他突变,利用同源重组法构建了p95基因定点插入突变的重组病毒AcGFP-P95in.PCR确认p95基因中插入了Tn5转座子;Western blot也证实AcApra41和AcGFP-P95in感染的细胞中,P95蛋白的分子量都因为插入突变而变小,由野生型的95 ku变为 55 ku.病毒复制动态曲线和荧光显微镜观察证实带有该插入突变的病毒能够在Sf9细胞中正常复制,并表达极晚期基因.这一结果表明完整的P95蛋白对病毒复制是非必须的.     

毕赤酵母新型反向筛选标记基因的鉴定

利用转座子突变技术构建毕赤酵母菌株突变库,并分离出能够在含雷帕霉素（10 ng/mL）培养基中生长的突变株mut375.通过热不对称交错PCR（TAIL-PCR）获取转座子侧翼序列,对转座子的插入位点进行定位.转座子插入PAS_Chr2-2₀375基因,破坏了其开放阅读框的完整性,将该基因命名为kFPR1.本研究利用同源重组敲除kFPR1基因使毕赤酵母产生了雷帕霉素抗性,回补该基因功能的菌株则不能在含雷帕霉素的培养基上生长.基于kFPR1基因的特性,建立了一种适用于毕赤酵母的无标记基因操作方法.以kFPR1作为反向筛选标记成功构建了表达EGFP的重组菌株并且回收了ZeoR筛选标记,为毕赤酵母的遗传操作提供了新的筛选工具.     

水稻OsDTH13基因编辑突变体的创制与分析

为了揭示水稻的PEBP基因家族成员OsDTH13的功能,以粳稻品种中花11为实验材料,利用CRISPR/Cas9技术创建了该家族成员OsDTH13的基因编辑突变体,对获得的编辑突变体进行测序分析确定其编辑类型.选择目的基因编码区的2个靶点,将其构建到基因编辑表达盒中获得了重组载体,并将重组载体导入农杆菌中,通过农杆菌介导的遗传转化法获得13株T_0代转基因阳性植株.经过测序鉴定,发现5株在靶点位置发生了编辑,其中2株为单碱基插入,3株为小片段的缺失.通过自交获得了T_1代纯合突变体植株.对获得的纯合突变体进行验证,发现其可以稳定遗传到下一代,这表明CRISPR/Cas9重组载体成功地对OsDTH13进行了编辑.     

表达人胰岛素前体的毕赤酵母菌株的构建

将人胰岛素前体 (HIP)基因插入到毕赤酵母Pichiapastoris的分泌表达质粒pPIC9K中,得到分泌表达质粒pPIC9K/HIP并用电转化法转化P.pastorisGS115。筛选出整合型His⁺Mut^s 菌株,进一步用G418筛选获得高拷贝转化子。经诱导培养后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)证明HIP在毕赤酵母中能有效分泌表达。对毕赤酵母中外源基因的稳定性进行了研究,结果表明外源基因在毕赤酵母中很稳定.     

从水稻白叶枯病菌分离的avrBs3家族新成员avrXa3是具双重功能的无毒基因

以转座子标签法从水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv oryzae Dye,Xoo)JXOⅢ基因组文库中筛选到两个阳性克隆pUAV45和pUAV47,其中pUAV45与avrXa10探针进行Southern印迹杂交后显示出同源性.pUAV45携带25.4kb的Xoo基因组DNA.将具有与avrXa10有杂交信号的亚克隆pUAV5K(5.7kb)转入PXO99中发现,接合子PXO99/pUAV5K与PXO99/pUAV45一样在水稻Wase Aikoku 3(Xa3)上表现为致病性明显降低;而在含Xa10抗病基因的水稻Cas209上,则致病性增强.携5.7kb的亚克隆pUAV5K经序列测定和分析后发现,其中含有一个全长2598bp的开放阅读框(ORF),包含有8.5个34个氨基酸的直接重复单元,1个亮氨酸拉链结构域(LZ),3个细胞核定位信号(NLSs)序列以及C端的酸性转录激活区域(AAD),与avrXa10高度同源.据此认为,该ORF是水稻白叶枯病菌JXOⅢ菌株中具双重功能即无毒性功能和侵袭力(症状表达)功能的无毒基因avrXa3,为avrBs3(avr/pth)家族的一个新成员.