瓶囊碘泡虫HSP70基因的克隆、鉴定及功能预测

HSP70(Heat shockproteins 70)是分子量约为70 k D的热休克蛋白,具有保护细胞和生命体的重要作用。通过分子克隆和染色体步移技术首次获得瓶囊碘泡虫(Myxobolus ampullicapsulatus Zhao et al.,2008)HSP70家族同源基因的完整序列,并利用生物信息学方法对该基因进行鉴定,同时对它编码的蛋白序列进行分析。结果显示:瓶囊碘泡虫HSP70蛋白为HSPA8同源物,命名为Ma HSPA8;Ma HSPA8基因核苷酸序列全长2 696 bp,共编码662个氨基酸,Ma HSPA8蛋白相对分子量为72.5 k D,等电点为5.37,无跨膜区和信号肽,共有24个潜在的抗原位点。此发现将为进一步研究HSP70基因在瓶囊碘泡虫寄生过程中的作用提供基础资料。
     

鲫葡萄糖调节蛋白78基因部分序列的克隆、鉴定及功能预测

【目的】分析和预测鲫(Carassius auratus)葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulated protein 78,GRP78)的功能,为研究GRP78在鱼类受细胞外刺激过程中的作用机制奠定基础。【方法】通过分子克隆技术获得鲫GRP78基因的部分序列,并利用生物信息学方法分析了该基因片段编码的蛋白质序列的二级结构、亲水性、可塑性、表面可及性和抗原表位。【结果】获得了长度为617bp的鲫GRP78基因片段序列,共编码113个氨基酸。这些氨基酸所构成序列的相对分子质量约为1.3kDa,等电点为5.82,无信号肽;可塑性区域位于第7～10位、第18～21位、第28～42位、第51～62位、第68～78位和第94～109位氨基酸残基;表面可及性区域位于第29～30位、第38～43位、第50～65位、第68～79位、第82～86位、第97～99位、第102～104位和第106～111位氨基酸残基;有1个B细胞抗原表位区域,位于第28～45位氨基酸残基。【结论】所获的鲫GRP78序列中含有ATPase保守结构域区段,该区段定位于内质网,具有较强亲水性。     

拟穴青蟹HSP70基因的克隆与组织表达

热休克蛋白70(HSP70)是一种重要的功能蛋白.利用RACE和基因克隆等分子生物学技术,获得拟穴青蟹(Scylla paramamosain)HSP70全长cDNA序列,全长共2 189 bp,包括110 bp的5′UTR(untranslated regions)、126 bp的3′UTR和一个1 953 bp的开放阅读框(ORF).ORF可编码650个氨基酸残基,总分子质量约为71.2 ku,pI为5.38.同源蛋白的比较结果显示,拟穴青蟹HSP70序列与其他一些物种具有很高相似性,推测HSP70基因具有很高的遗传保守性,而基于HSP70氨基酸序列比对而绘制的系统树基本能够反映出各物种间的进化关系.以RT-PCR法检测雌性拟穴青蟹一些组织中的HSP70表达,结果显示各待测组织中均能扩增得到HSP70,说明HSP70在拟穴青蟹为组成型表达.其中,HSP70在卵巢中表达量最高,其次为脑神经节,推测这与HSP70作为分子伴侣的功能相关.     

细菌脂多糖中GDP-colitose糖合成基因的预测、克隆及表达鉴定

colitose糖存在Salmonella enterica O50、S.enterica O35、E.coli O111、E.coli O55和Vibrio choleraeO139等少数几种细菌的O-抗原中.GDP-colitose糖的合成酶基因分别为wbdJ、wbdK和gmd.用PCR的方法扩增出三种基因的片断,克隆到表达载体pCAL-c中,从而构建了表达质粒pLW1、pLW4、pLW7,转化到大肠杆菌BL21-Gold中,获得工程菌株B10,B11,B12.IPTG诱导表达,纯化得到三种电泳纯的表达产物,分子量分别约为35kD,44kD,42kD,与预测结果相似.     

口腔碘泡虫宿主新纪录及种群分化研究

【目的】研究口腔碘泡虫(Myxobolus oralis)宿主新记录及种群分化。【方法】基于形态特征、18S r DNA序列相似度、遗传距离、变异位点、系统发育以及18S rRNA序列V4区二级结构的预测,对口腔碘泡虫江西种群和湖北种群进行了比较分析。【结果】口腔碘泡虫江西种群与湖北种群形态学特征基本一致;两种群18S r DNA序列相似度为99%,变异位点数为6个,遗传距离为0.003,18S rRNA序列V4区二级结构无差异;口腔碘泡虫湖北种群先于江西种群分化出来。【结论】口腔碘泡虫与宿主可能并未经历协同进化的自然历史过程;口腔碘泡虫可能先寄生于异育银鲫(Carassius auratus gibelio),然后少数个体偶然发生宿主转移事件而进入鲫(Carassius auratus auratus)体内并在长期的进化中逐渐适应这种新的寄生关系,最终形成新的种群或亚种。     

淞江鲈HSP70基因cDNA部分序列克隆及其组织表达差异

为了研究HSP70(heat shock protein 70)是否可作为淞江鲈(Trachidermus fasciatus Heckel)养殖中的应激监测分子指标,根据鲤鱼热应激蛋白70基因序列(AYl20894)设计并合成引物,以淞江鲈肝脏组织总RNA为模板,获得淞江鲈HSP70基因cDNA部分序列,长度为480bp,GenBank登陆号为KC342053.序列分析结果显示此序列与红笛鲷(Lutjanus sanguineus)等有较高的同源性.同时,应用所获淞江鲈HSP70基因部分序列,以淞江鲈β-actin基因的序列(HM449124)为内参,利用荧光定量PCR技术,检测淞江鲈肌肉、肠、脑、皮肤、性腺、肝脏、心脏、鳃、鳍9个组织的表达差异.结果表明,HSP70在淞江鲈9个组织中普遍表达,其中在鳍中表达量最高,在性腺、鳃、脑、肌肉、肝脏、皮肤、肠中的表达量依次递减,在心脏中表达量最低.在鳍中HSP70的表达量可能成为衡量淞江鲈应激程度的指标.     

蜡梅热激蛋白基因 Cp HSP70-1的克隆、亚细胞定位与表达分析

在已构建的蜡梅花转录组数据库EST序列分析的基础上,采用 RACE技术克隆获得蜡梅热激蛋白 HSP70的cDNA序列,命名为CpHSP70‐1（GenBank登录号：KR071130）．该序列全长2520 bp ,包括1962 bp的完整开放阅读框,编码653个氨基酸蛋白序列,含有3个 HSP70家族典型基序．CpHS P70‐1蛋白与其他真核生物的HSP70蛋白具有较高的同源性,聚类分析显示其属于定位于细胞核／细胞质的蛋白．亚细胞定位结果支持该蛋白分布于细胞核的预测．利用实时荧光定量PCR对 CpHS P70‐1基因的表达特性进行分析,其在各组织中均有不同程度的表达,其中在成熟叶片中表达量最高;在不同花发育阶段呈现持续稳定的表达模式;该基因在低温和高温诱导下表达量提高,而且对高温的响应更为敏感．     

鲢碘泡虫营养体细胞化学的初步观察

鲢碘泡虫 Myxobolus driagini是鲢疯狂病的病原体,隶属于粘孢子纲 Myxosporea Bü tschli,1984、双壳目 Bivalvulida Shulman,1959、碘泡科 Myxobolidae Thelohan,1892,主要侵袭鱼的神经系统和感觉器官,导致鱼极度消瘦,行动异常,失去平衡而死亡 [1,2]。 　　有关粘孢子虫营养体细胞化学的研究,国内外报道较少。 Noble[3]报道了 Ceratomyxa blennius营养体内存在着糖类和蛋白质; Chakravarty和 Maiti等 [4]分别报道了三种碘泡虫（ Myxobolus）营养体内存在着核酸; Desser和 Paterson[5]发现寄生于 Common Shiner Notropis C…     

珙桐AP2/ERF家族相关基因的克隆及功能鉴定

为探究AP2/ERF类转录因子在珙桐开花调控及花器官发育中的作用,本研究通过从实验室珙桐不同发育时期苞片和叶片的转录组数据中筛选出调控珙桐苞片发育相关AP2/ERF家族基因DiAP2-1、DiDREB-1和DiRAV-1,经过生物信息学分析、基因克隆及功能鉴定初步研究了目的基因在珙桐苞片发育过程中的调控机制.亚细胞定位实验显示DiAP2-1主要定位于细胞质,DiDREB-1和DiRAV-1主要定位于细胞核.对目的基因在珙桐中的表达模式分析发现DiAP2-1和DiRAV-1在苞片发育过程中表达量逐渐降低,DiDREB-1只在苞片第三时期高表达,推测DiDREB-1、DiRAV-1属于A类基因,DiAP2-1属于B类基因.表型实验显示DiDREB-1和DiRAV-1转基因拟南芥株系较野生型表现为明显的早花,DiAP2-1同源基因对应的拟南芥突变体与同一时期野生型拟南芥对比表现为花瓣减少且萼片大,角果呈短粗状且败育.对关键开花调控基因表达模式分析发现DiDREB-1和DiRAV-1异源表达后使其他促花因子表达量上调进而使拟南芥花期提前.以上结果表明,AP2/ERF类转录因子DiAP2-1、D...     

大鼠Neuritin基因启动子区克隆、鉴定及生物信息学分析

目的本研究旨在了解大鼠Neuritin基因启动子区特征,为明确神经受损后的再生中Neuritin基因在体内转录水平的调控提供理论依据。利用比较基因组学获取较为可靠的置信序列并设计上、下游引物克隆大鼠Neuritin基因5'调控区片段。方法采用生物信息学方法分析扩增片段序列特征,并采用多款转录因子预测软件预测大鼠Neuritin基因启动子主要调控区的转录因子结合位点。结果研究结果表明成功克隆出3447 bp大鼠Neuritin 5'调控区序列,大鼠Neuritin 5'调控区序列与小鼠同源率为91. 1%。生物信息学方法分析发现距大鼠Neuritin基因CDS区上游740～1012 bp位置处有一个Cp G岛,224 bp处有一个TATA-Box,初步推测大鼠Neuritin基因CDS区上游1100 bp为主要核心启动子区域。利用生物信息学软件预测主要调控区域含有AP-1,AP-2,AP-4和CREB等八个重要的转录因子结合位点。结论本研究大鼠Neuritin基因启动子的鉴定和相关转录因子结合位点的发现为进一步研究大鼠Neuritin基因的表达调控奠定了数据基础。     

中国梨S RNase基因启动子的TAIL PCR 克隆及功能预测

利用TAIL PCR技术从中国砂梨品种‘金花’、‘懋功’及白梨品种‘鸭梨’基因组DNA中分 别扩增出长度为854、1 448和1 137 bp的S13-、S12-、S21-RNase基因5′端上游序列,并提交 GenBank,序列号为HM047239、HM047240、HM047241。经PLACE和PlantCARE软件顺式调控元件预测发 现,这3个启动子均具有典型核心启动子TATA 盒和 CAAT 盒,且在上游均存在光应答调控元件(box 4,G box)、脱落酸应答元件ABRE及水杨酸应答元件TCA element等,由此可知其可能受光照、脱 落酸、水杨酸等多种条件的共同调节。此外,与已知日本梨S2-、S3-、S4-、S5-RNase基因启动子序 列比对发现,S RNase启动子TATA盒上游存在一约200 bp的同源区域。以MEG 4.0构建系统发育树表 明,梨属和苹果属S RNase等位基因多态性可能在亚科的分化之前就已形成。     

日本鳗鲡COX-2基因的克隆、鉴定及表达分析

应用PCR及RACE技术从日本鳗鲡(Anguilla japonica)中克隆获得一个2463 bp环氧化酶基因(Cyclooxygenase-2,AjCOX-2)的cDNA序列.AjCOX-2前体为606肽,含有脊椎动物COX-2的保守结构域,以及加氧酶和过氧化物酶的活性位点.在正常生理条件下,AjCOX-2基因在日本鳗鲡的鳃、鳔和皮肤中高水平转录表达.脂多糖刺激后8 h,AjCOX-2基因在皮肤和鳔中的转录表达显著上调(P0.05);多聚胞苷酸刺激后8 h,AjCOX-2在皮肤、鳔和鳃中的转录表达显著上调(P0.05);迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)刺激后8 h,AjCOX-2在鳔中的转录表达也极显著上调(P0.01).结果表明,AjCOX-2基因是对外来病原刺激的早期响应基因,参与机体抵抗外来刺激物的先天免疫应答.     

口腔碘泡虫宿主新纪录及种群分化研究

【目的】研究口腔碘泡虫(Myxobolus oralis)宿主新记录及种群分化。【方法】基于形态特征、18Sr DNA序列相似度、遗传距离、变异位点、系统发育以及18Sr RNA序列V4区二级结构的预测,对口腔碘泡虫江西种群和湖北种群进行了比较分析。【结果】口腔碘泡虫江西种群与湖北种群形态学特征基本一致;两种群18Sr DNA序列相似度为99%,变异位点数为6个,遗传距离为0.003,18Sr RNA序列V4区二级结构无差异;口腔碘泡虫湖北种群先于江西种群分化出来。【结论】口腔碘泡虫与宿主可能并未经历协同进化的自然历史 过 程;口 腔 碘 泡 虫 可 能 先 寄 生 于 异 育 银 鲫(Carassius auratus gibelio),然后少数个体偶然发生宿主转移事件而进入鲫(Carassius auratus auratus)体内并在长期的进化中逐渐适应这种新的寄生关系,最终形成新的种群或亚种。
     

抑癌基因的定位、鉴定和克隆研究

中国医科大学基础医学院张学等2001年度辽宁省自然科学奖一等奖肿瘤遗传学是近10年来医学遗传学中最活跃和取得重大突破最多的领域之一。抑癌基因则一直是该领域研究的前沿和热点。抑癌基因研究对阐明细胞增殖、分化、凋亡和癌变的机理,实现肿瘤的准确基因诊断和有效基因治疗有重要理论和实践意义。该项目在卫生部等基金资助下,围绕抑癌基因的定位、鉴定和克隆开展了系列研究。主要研究成果包括:第一,人肝癌的杂合性丢失和抑癌基因研究。通过染色体缺失定位、基因突变分析和蛋白表达检测,在国际上首次确定RB1基因在进展期肝癌中突变失活。…     

芽孢杆菌S6内切葡聚糖酶基因的克隆及功能鉴定

为了开发高效拮抗真菌新产品,从土壤中分离一株具有高效拮抗黄萎病、枯萎病功能的菌株芽孢杆菌S6(Bacillus subtilis S6),通过同源克隆、生物信息学分析、p ET-21b表达载体构建、聚丙烯酰胺凝胶电泳和羧甲基纤维素平板检测等方法分析其结构和功能。结果表明:获得了1 500 bp的β-1,4-内切葡聚糖酶基因(glu)全长序列;glu编码499个氨基酸,在1—30位氨基酸存在信号肽,蛋白的成熟位点在第29—30位的氨基酸残基之间,而该蛋白仅有一个跨膜区段,蛋白分子量约为50 ku,在大肠杆菌BL21中成功表达且具有极高的酶活性。     

天花粉蛋白基因的克隆、表达和活性鉴定

用PCR（Polymerase Chain Reaction)扩增出天芬粉蛋白（Trichosanthin,TCS)基因全长序列，插入表达载体，经双酶切鉴定及测序分析，表明阅读框正确，表达His-TCS活性融合蛋白并纯化天花粉蛋白，鉴定出其具有RNA N－糖苷酶活性和抗原抗体结合活性。     

荧光假单胞菌phlD基因的克隆、表达及功能

对荧光假单胞菌合成2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)操纵子的关键基因phlD进行了克隆,并采用E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)对phlD进行了诱导表达,其指导合成的PhlD蛋白融合表达后为42000Da.生物信息学方法分析PhlD具有PKSⅢ型聚酮合酶的结构及催化聚酮缩合、酰基转移反应的功能,并推测PhlD催化底物丙二酸单酰辅酶A经过聚酮缩合途径合成间苯三酚及其衍生物.对重组菌进行了摇瓶发酵并检测出发酵液中确有产物间苯三酚的合成.     

异色瓢虫的HSP90基因的克隆与特性分析

采用同源克隆和锚定PCR技术,从异色瓢虫Harmonia axyridis(Pallas)中克隆到热休克蛋白HSP90基因的cDNA全序列(Genbank number:FJ501962)。cDNA全长2 480 bp,包含3′非编码区域(UTR)为200 bp和5′UTR为126 bp,开放阅读框(ORF)长2 154 bp,编码717个氨基酸。预测的相对分子质量为82 230,理论等电点为4.96,无糖基化位点、跨膜结构和信号肽。在N端具有HSP90基因保守的ATPase结构,含有HSP90家族的C末端的保守序列EEVD。与赤拟谷盗Tribolium castaneum相比较,同源性高达90%,系统发育分析也表明两者的亲缘关系最近。HaaHSP90基因的克隆和比较分析为进一步深入研究异色瓢虫的抗逆机理及其进化具有重要意义。     

克隆与序列分析中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）HSP70基因全长ORF的RACE

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆中华绒螯蟹(Edocheirsinensis)的Hsp70基因并进行序列分析.以中华绒螯蟹卵组织cDNA为模板,克隆测序后拼接得到一条长2 429 bp的cDNA序列,序列分析表明其覆盖了完整编码区,编码649个氨基酸.经antheprot分析发现2个Hsp70基因的签名序列:IFDLGGGTFDVSIL,IVLVGGSTRIPKIQK;Dnak特征基序DLGTF-S-V;非细胞器基序:RARFEEL;核定位信号标签:KKDPSESKRALRRL;胞质Hsp70特征基序GPTIEEVD.经BLASTn和BLASTx软件分析,该编码区核苷酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus uannamei)、斑节对虾(Penaeus monodon)的相似性分别为85.30%和84.89%.根据核苷酸序列所推导出的Hsp70氨基酸序列,其与斑节对虾、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)的相似性分别为93.23%和93.40%.本研究克隆了中华绒螯蟹的Hsp70基因,为进一步深入研究锯缘青蟹的抗逆机理及其遗传改良奠定了基础.     

拟松材线虫两个HSP基因的克隆与分析

采用RACE(快速扩增cDNA末端)技术从拟松材线虫中克隆了HSP70蛋白编码基因mc2和HSP90蛋白编码基因mc19,两个基因的全长cDNA分别为2 067和1 222 bp。生物信息学分析结果表明：mc2基因的ORF为1 926 bp,推测的编码蛋白包含642个氨基酸,分子质量为170.85 ku,等电点为4.69。mc19基因的ORF为1 083 bp,推测的编码蛋白包含361个氨基酸,分子质量为97.70 ku,等电点为4.83。多序列比对和系统进化树结果分析都表明,拟松材线虫的mc2、mc19基因的编码蛋白与植物寄生线虫HSP70和HSP90蛋白具有较高的同源性,拟松材线虫和松材线虫之间的亲缘关系尤其密切。