甘蓝型油菜Toc33基因启动子的克隆及序列分析

叶绿体是植物细胞中重要的细胞器,大部分叶绿体蛋白质都是由核基因组编码,在细胞质中合成分子量较大的前体蛋白,转运至叶绿体实施其功能．TOC33／TOC34是叶绿体上发现的一个外膜蛋白转运器构件蛋白,它与TOC159、TOC75和TOC64相互作用,构成了叶绿体外被膜上的一个蛋白转运器．目前已从豌豆（Pisumsa tizrurn）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）、小立碗藓（Physcomitrella patens）、诸葛菜（Orychophragmus violaceus）和油菜（Brassica napus）克隆到TOC33或TOC34的cDNA或DNA的编码区．与其功能研究相比,Toc33基因的表达调控研究较少,该基因5’端调控区域的克隆及序列分析均未见报道．为此,在本实验室已经克隆到甘蓝型油菜Toc33基因编码区的基础上,采用单引物PCR方法进行染色体步移,克隆出Toc33基因的启动子,为进一步研究Toc33基因的转录调控机制奠定基础．     

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)矮秆突变位点的RAPD标记

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是世界主要油料作物,在我国农村产业结构调整与提高城乡人民生活水平方面具有重要意义,目前大规模种植的油菜均为高秆品种,在结实中后期容易产生倒伏,影响籽粒充实,并易于病害发生,造成的减产达20％～30％,严重的甚至会颗粒无收,对油菜生产的发展影响巨大。     

甘蓝型油菜（Brassica napus L.）叶片形态的非孟德尔式遗传研究

本文研究表明，甘蓝型油菜（B.napusL.)叶片形态偏离正常的孟德尔式遗传，正反交F2与回交B2世代之间性状分离结果呈现出显著差异，而且这种分离差异在高世代衍生家系间以及不同交配系统中和不同年度间表面一致。作者提出了“质核互作对异源基因配子的优先选择”假说以解释这种异常遗传行为。文中还详细讨论了其他一些假说的不适合性，以及前人在叶形遗传研究中可能存在的局限性。     

甘蓝型油菜胚柄多胚突变体(Brassica napus twn-119)的细胞胚胎学研究

多胚突变体B.napus twn-119是从甘蓝型油菜品种中油119中发现的.经过连续套袋自交选育,目前已使多胚频率提高到34%.所获得的多胚种子萌发后,92%的种子中萌发出各自独立的双苗,6%种子中萌发出独立三苗,2%的种子中得到3个以上独立苗.偶尔可观察到生长的幼苗具有三片、四片子叶、幼苗的茎发生部分结合及子叶上具轴状附属物等异常现象.对多胚突变体的胚胎学研究表明,由顶细胞发育而来的初生胚体正常发育成胚,部分胚柄细胞转变成为具有强烈分裂能力的细胞而不是进入程序性死亡.这些特殊的胚柄细胞具有胚胎发生能力,胚柄中可以观察到多个球形原胚形成,多个原胚由宿存的胚柄细胞连接成一串.如果两原胚之间连接的胚柄细胞很少或没有,两个胚体在发育过程中会发生部分融合.幼苗根尖染色体数目的检查也证明多胚幼苗都具有正常油菜的染色体数目(2n=38).     

甘蓝型油菜G蛋白β亚基基因的克隆和表达分析

根据拟南芥等G蛋白β亚基基因的DNA序列,采用RT-PCR技术从甘蓝型油菜中克隆了一个编码G蛋白β亚基基因的全长cDNA,命名为BnAGB1.BnAGB1含有1134 bp的完整开放阅读框,编码378个氨基酸,与其它植物的Gβ亚基氨基酸序列有很高的同源性,且具有保守的Gα、Gγ结合区域及WD-40结构域.对甘蓝型油菜矮化突变体及其野生型中不同组织和不同发育时期的BnAGB1表达进行实时定量PCR分析表明:BnAGB1在矮化突变体和野生型的各个组织中均有表达;在生长旺盛期的子叶期、抽薹期和荚果期有较高的表达,而在两片真叶期、四片真叶期和花期表达较低;而且,在所有分析的不同时期和组织中,矮化突变体中的表达均显著或极显著高于野生型.以上结果表明,BnAGB1参与了甘蓝型油菜的生长发育进程的调控,与油菜矮化突变性状表现可能相关.     

甘蓝型油菜植物防御素基因的克隆与原核表达

根据Genbank上已知的植物防御素基因设计引物,以甘蓝型油菜中的品种”蜀杂九号”种子总RNA反转录成的eDNA为模板,进行PCR扩增,获得了243bp的片段．将该片段回收。连接到pMD18-T载体测序,将测序片段经酶切回收后克隆到GTK表达载体中,在0．1mmol IPTG诱导下表达出与理论值相符的34kD的融合蛋白条带,用GST单克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测,获得阳性结果,这为甘蓝型油菜植物防御素基因功能的进一步研究提供了基础．     

幼叶黄化油菜(Brassica napus L.)突变体Cr3529叶绿体超微结构观察

对油菜Cr3529叶片细胞中的叶绿体数目及结构进行了显微及亚显微观察。结果显示，突变与野生型细胞中叶绿体的数目没有显著性的差异，但叶绿体的结构有较大的差异，较之正常油菜，Cr3529油菜叶绿体基粒类囊体数较少，基质类囊体数较多，而且，在基粒类囊体中基粒片层数也较少，大部分基粒只有几个片层，基粒的平均片层数为5．46，约为野生型的一半，作者认为，较少的基粒片层数可能是引起Cr3529油菜叶绿素含量减少，并最终导致植株显著减产的重要原因。     

锰胁迫对甘蓝型油菜Brassica napus L.种子活力和幼苗抗氧化系统的影响

用不同质量分数的锰溶液(0.2%,0.4%,0.8%和1.2%Mn2+)处理甘蓝型胜利油菜Brassica napuscv.Shengli,研究锰对其种子活力、幼苗细胞膜透性、脂质过氧化及抗氧化剂的影响.结果表明:锰胁迫降低了种子活力、幼苗抗坏血酸(Vc)质量分数、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性,破坏了细胞膜的完整性,并使丙二醛(MDA)质量分数、脯氨酸(Pro)质量分数和过氧化物酶(POD)活性增加.     

甘蓝型油菜BnbHLH122基因的克隆、表达模式及胁迫响应分析

为了进一步探究甘蓝型油菜bHLH转录因子的生物学功能,本实验采用同源克隆技术从甘蓝型油菜中克隆了2个bHLH122转录因子基因全长cDNA序列,分别命名为:BnbHLH122-1(GenBank登录号为MT795160)和BnbHLH122-2(GenBank登录号为MT795161).生物信息学分析表明,BnbHLH122-1和BnbHLH122-2蛋白为不稳定的亲水性蛋白,都含有bHLH保守结构域,分别与白菜和甘蓝中预测的bHLH122蛋白的亲缘关系最近.亚细胞定位和转录激活活性验证实验结果表明两个BnbHLH122蛋白均定位在细胞核且具备转录激活活性.qRT-PCR实验结果表明BnbHLH122-1基因主要在花期的根中表达,BnbHLH122-2基因主要在苗期的根和花期的花中表达.此外,高温、低温、干旱、高盐、渗透、核盘菌胁迫以及ABA、SA、MeJA激素处理均能显著影响BnbHLH122基因的表达,由此说明甘蓝型油菜BnbHLH122基因可能在维持植株正常的生长发育和抵御逆境胁迫过程中发挥重要调节作用.     

甘蓝型油菜BnBRI1基因的克隆及表达分析

以拟南芥油菜素内酯受体BRI1基因序列设计同源简并引物,利用同源克隆技术,克隆了甘蓝型油菜中编码油菜素内酯受体基因全长cDNA序列,命名为BnBRI1(GenBank:JX871217),该基因开放阅读框(ORF)大小为3591bp,与拟南芥中BRI1基因(GenBank:NM_120100)相似性为94.21%,编码1196个氨基酸,与拟南芥中BRI编码的氨基酸相似性为89.23%.采用实时定量PCR分析表明,BnBRI1基因在根、茎、叶中都有表达,但表达量存在显著差异.在两叶一心期和花期的根中表达量最高,四叶一心期和抽薹期的叶中表达量最高.     

转EPSPS基因抗草苷膦油菜基因漂移的初步研究

草苷膦是一种广谱内吸传导型除草剂[1].草苷膦通过竞争性抑制植物莽草酸代谢过程中磷酸烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(简称为EPSPS)活性,阻断芳香族氨基酸的生物合成导致植物死亡[2].因此,转EPSPS基因(来自微生物的基因)作物对草苷膦类型的除草剂具有抗性.在1996~2004年的9年间,抗除草剂生物技术产品一直占市场的主导地位.2004年,全球种植的抗除草剂的转基因作物有油菜、大豆、玉米及棉花等,种植面积共计有5,860万公顷,占全球转基因作物总种植面积(8,100万公顷)的72%.抗除草剂油菜品种在国外已广泛种植,据国际农业生物技术应用服务组…     

芸苔EPSPs基因cDNA的克隆和表达载体的构建

作者从芸苔(Brassica campestris)中用RT-PCR方法获得了EPSPs基因的cDNA．与其他物种中的EPSPs基因进行了比对和分析发现：芸苔EPSPs基因的cDNA与欧洲油菜的同源性最高,为93％,与水稻同源性最低,仅为64％．将芸苔EPSPs的ORF片段插入到GTK融合表达载体中,为EPSPs的原核表达奠定了基础。     

Cloning the Promoter of BcNA1 from Brassica napus and Fad2 Gene from Arabidopsis thaliana and Construction of the Plant Expression Vector

The upstream regulatory region of a seed-specific gene was isolated from the genomic DNA of Brassica napus by PCR amplification. The cloned fragment contained 1755 nucleotides, and shared a sequence homology of 99.6% with the reported data. The coding region of oleic acid desaturase gene was then cloned from Arabidopsis thaliana. The sequencing analysis indicated that the sequence of the PCR product was just the same as reported before. In addition, the plant expression vector harboring the seed-specific promoter and trans-Fad2 gene was constructed.     

不同根肿病抗性油菜根系分泌物的代谢组研究

为了探究寄主根系分泌物中对根肿菌休眠孢子萌发具有重要作用的代谢物,本研究首先测试了甘蓝型油菜不同根肿病抗性材料的根系分泌物对休眠孢子萌发的诱导能力,发现易感材料根系分泌物处理组的萌发率显著高于抗性材料处理组.进一步采用非靶向液相色谱-质谱联用代谢物分析法检测了抗病材料和易感材料的根系分泌物,在负离子(ESI-)模式下鉴定出次级代谢产物1079个,在正离子(ESI+)模式下鉴定出次级代谢产物1257个,其中差异代谢物分别为662和722个.选取部分差异较大的代谢物进行验证,结果表明,胸腺嘧啶,2′-脱氧尿苷,L-异亮氨酸,葫芦巴碱,磷酸吡哆醛,香豆素,D-来苏糖和穗花杉双黄酮等对休眠孢子萌发具有显著促进作用,继而影响根肿病的发生.     

甘蓝型油菜独脚金内酯相关基因的克隆与表达分析

独脚金内酯(strigolactones,SLs)是一类新鉴定的植物激素,参与抑制茎分枝.采用同源克隆技术自甘蓝型油菜中得到了三个SLs相关基因,分别命名为BnMAX4,BnMAX1和BnD14,其CDS各长1707,1593,804bp,推测编码的蛋白质功能分别为β-类胡萝卜素加氧酶,细胞色素P450,α/β水解酶.RT-qPCR表达分析显示在野生型甘蓝型油菜二叶及四叶一心期的各组织器官中,BnMAX4主要在二叶一心期的根中表达;BnMAX1无明显表达优势组织;BnD14在二叶一心期的叶中高表达.旱胁迫及盐胁迫处理时BnMAX4的表达趋势为骤降;BnMAX1旱胁迫处理时表达量降低,盐胁迫处理时先下降后上升,9h后又下降;BnD14旱胁迫处理时在3h与12h各有两个表达高点,盐胁迫处理时在3h表达量最高.     

甘蓝型油菜乙醇酸氧化酶(GO)基因片段的克隆及hpRNA表达载体构建

通过PCR从甘蓝型油菜(Brassica napus)华双4号基因组DNA中扩增出乙醇酸氧化酶(GO)基因片段,DNA序列分析表明扩增GO基因片段的外显子部分与报道序列相同.以扩增出的GO基因片段作模板从一端设计引物扩增出一个相应的小片段.将GO基因大小两个片段反向连接,插入到植物表达载体2300-nap的napin启动子和nos终止子之间,植物表达载体2300-35S的35S启动子和nos终止子之间,分别构建成可转录表达出发夹RNA(hairpin RNA,hpRNA)结构的种子特异型和组成型油菜hpRNA干扰载体.     

棉花类耐盐锌指蛋白基因的克隆与结构分析

从棉花花瓣cDNA文库中随机挑选部分克隆，经测序发现一个与拟南芥耐盐锌指蛋白基因同源的cDNA(CSTZ),CSTZ序列全长1012bp，开放阅读框共编码272个氨基酸，含典型的植物双锌指（Cys2/His2)结构区，Northern杂交证实，CSTZ的表达随棉花幼苗钠盐处理浓度的升高而增强，在棉花花龄期，CSTZ基因在叶片，根，花瓣和花药组织中大量表达，在柱头组织中表达相对较弱。     

甘蓝型油菜和Lesquerella fendleri fad2基因片段克隆及hpRNA植物表达载体的构建

首先利用PCR从甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和Lesquerella fendleri基因组DNA中分别扩增出Δ12-脂肪酸去饱和酶fad2基因片段,再以扩增出的片段为模板设计引物从一端扩增出相应的小片段,然后将同一基因的大小片段反向连接,插入到种子特异表达载体2300-nap多克隆位点的napin启动子和nos终止子之间,构建成可以在种子中转录表达发夹RNA(Hairpin RNA,hpRNA)结构的植物表达载体.     

带幼叶黄化性状标记的油菜双重不育系选育

通过杂交、自交、兄妹交以及回交的方法,选育到带幼叶黄化性状(Cr)标记的双低双重不育系Z01—1A及相应保持系Z01-2AB,经过4年的观察,Z01—2AB兄妹交后代的育性比例稳定在1：1,可育株自交后代育性比例稳定在3：1;Z01-1A中CMS植株与D-MS植株的比例保持在1：1．用Z01—1A配制了5个双低组合,其产量比较的结果显示,5个组合均比对照种增产,其中3个组合的增产达到显著或极显著水平。