农杆菌介导转化豆科牧草百脉根影响因子

对农杆菌介导转化豆科牧草百脉根的相关影响因子进行了实验研究,结果表明:在百脉根农杆菌转化体系中,以农杆菌AGL1菌株、子叶转化受体、3 d共培养时间以及25 mg/L卡那霉素筛选质量浓度为最佳转化条件.研究还发现,头孢霉素对农杆菌AGL1菌株的抑制作用要强于羧苄霉素.     

提高根癌农杆菌介导黑曲霉转化效率的研究

为提高根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导黑曲霉(Aspergillus niger)转化(ATMT)效率,本文对影响转化效率的分生孢子与农杆菌的比例、转化媒介、诱导溶氧、诱导时间、诱导时乙酰丁香酮(AS)浓度这5个因素进行单因素实验,最终确定提高其转化效率的最优条件为:根癌农杆菌诱导过程在400,μmol/L乙酰丁香酮终浓度条件下,100,m L三角瓶中28,℃、100,r/min振荡培养5,h,分生孢子与根癌农杆菌的比例为1﹕100,在硝酸纤维膜媒介上24,℃共培养48,h.在此优化条件下,黑曲霉的转化效率达到35个/107分生孢子.相比于优化前,转化效率提升了78%,,并且整合至黑曲霉基因组的外源潮霉素B抗性基因在转接15代以后仍能稳定遗传.     

根癌农杆菌介导的丝状真菌简青霉遗传转化的研究

利用根癌农杆菌LBA4404介导,建立了丝状真菌简青霉(Penicillium simpli-cissimum)H5的遗传转化系统.潮霉素抗性筛选、PCR和Southern blot分子鉴定等结果表明:筛选获得的转化子能够稳定遗传,外源的T-DNA以单拷贝随机整合到简青霉的基因组中.实验初步研究了农杆菌浓度、乙酰丁香酮浓度和共培养时间等因素对转化效率的影响,经过优化后转化体系的效率可达50个转化子/105个孢子.农杆菌介导的遗传转化方法在简青霉上的运用,将为研究该菌的基因工程改造提供强有力的工具.     

农杆菌介导的棉花遗传转化过程中诸因素对出愈率的影响

研究了农杆菌介导的棉花遗传转化过程中影响外植体出愈率的一些相关因素.结果表明:卡那霉素(Kan)的浓度以50 mg/L或75 mg/L为最好,农杆菌菌株EHA105的浸染能力较强,7 d苗龄的棉花无菌苗下胚轴为最佳的遗传转化外植体材料,下胚轴外植体经预培养后再经农杆菌菌液浸染更有利于胚性愈伤组织的形成,同时农杆菌菌液浸染时间以3 min为最佳.     

根癌农杆菌介导的向日葵遗传转化的研究

以向日葵无菌苗的子叶节为外植体,通过农杆菌介导法,对其遗传转化条件进行了研究,建立了向日葵子叶节农杆菌介导的遗传转化体系.结果表明:在农杆菌浸染前(浸染浓度为OD600=0.6)进行2 d的预培养、浸染8 min的外植体在MS+1.2 mg/L 6-BA+0.03 mg/L IAA的培养基上转化效率较高.PCR检测初步证明,LycB基因已整合到向日葵再生植株中.     

根癌农杆菌介导的骏枣愈伤组织遗传转化体系的研究

采用农杆菌介导法,对骏枣愈伤组织遗传转化体系进行研究.结果表明：进行遗传转化的合适条件为：愈伤诱导培养基MS＋6-BA 0.4 mg/L＋2,4-D 1.2 mg/L;浸染之前对愈伤组织进行6d的避光培养可提高愈伤组织在共培养过程中的成活率;愈伤组织在OD600=0.4～0.6的农杆菌菌液中浸染10 min,农杆菌LBA4404的生长情况最好;在28℃黑暗条件下共培养放置16 d对转化最适宜;头孢霉素的抑菌浓度为250 mg/L;卡那霉素的筛选浓度为125 mg/L.经PCR检测,初步证明外源目的基因已整合到骏枣基因组中,初步实现了农杆菌介导的骏枣愈伤组织遗传转化,与以骏枣茎叶外植体建立的遗传转化体系相比,以骏枣愈伤组织为外植体共培养时间长,有利于转化.     

农杆菌介导的小麦成熟胚愈伤遗传转化研究进展

小麦是中国重要的粮食作物之一.传统的育种方法存在周期长、改良慢等缺点,基因工程育种现已成为小麦遗传改良的研究热点.因此,小麦成熟胚愈伤组织的遗传转化在小麦遗传改良研究中具有重要意义.农杆菌介导的小麦成熟胚愈伤组织的遗传转化以其自身具有的优势,得到了广泛的关注.介绍了农杆菌介导的小麦成熟胚愈伤遗传转化体系的各种影响因素,如小麦愈伤组织的诱导、分化、转化效率、农杆菌菌株和转化载体等,并对小麦成熟胚愈伤组织遗传转化的发展方向进行了展望.     

核盘菌交配型基因mat1-1敲除载体的构建及转化

利用根癌农杆菌介导真菌遗传转化方法对核盘菌的交配型基因mat1-1进行基因同源重组的敲除对比实验,获得了缺失mat1-1基因的转化菌株.先利用PCR方法获得mat1-1基因的左右两侧片段,将测序正确的两个侧翼片段分别重组到农杆菌转化载体PBI-G3C中,并将新霉素抗性标记引入农杆菌转化载体PBI-G3C中,构建成农杆菌介导转化核盘菌的打靶载体ΔPBI-G3CN-mat1-1,再将ΔPBI-G3CN-mat1-1质粒转化至根癌农杆菌EHA105中.利用核盘菌菌丝进行转化,将得到的转化菌株,利用PCR方法进行验证,证实有敲除菌株存在.通过对敲除菌株进行生理表型的测定发现,缺失mat1-1基因的敲除菌株其生长速度与野生核盘菌菌株相比无明显差异,但敲除菌株不能产生菌核与子囊盘.     

小球藻表达β胡萝卜素酮化酶基因提高虾青素的量

文章以G418抗性基因(NPTⅡ)作为选择标记基因,建立以PBI121为表达载体,农杆菌为介导的小球藻(Chlorella zofingiensis)遗传转化体系。确定了G418质量浓度为0.8 mg/L和羧苄青霉素质量浓度为500 mg/L的小球藻筛选体系,GFP为报告基因,从DNA和RNA水平上鉴定转化子阳性,通过激光共聚焦检测到了GFP的表达,从而建立了农杆菌转化体系。为提高小球藻的虾青素表达量,文章克隆八氢番茄红素脱氢酶基因信号肽PDSSP为信号肽以及克隆β-胡萝卜素酮化酶基因Crto,用overlap聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术构建PDSSP-Crto融合基因,并将融合基因克隆至表达载体PBI121∶35S∶PDSSP-Crto,利用上述农杆菌介导小球藻遗传转换方法转化小球藻。结果表明,转化子小球藻虾青素的质量比为0.564 mg/g,野生型为0.345 mg/g,比野生型高63.5%,有效地提高了小球藻虾青素的表达量。     

利用根癌农杆菌介导的转化方法改良木霉菌

根癌农杆菌介导的转化系统在丝状真菌的研究中具有重要的意义。通过农杆菌介导,成功实现了丝状真菌绿色木霉菌(Trichoderma viride)遗传转化,转化率约为30～80个转化子／10^5个孢子。PCR检测和几丁质酶分析表明含有编码几丁质酶外源基因(Cli 113)的T-DNA已整合进木霉菌基因组中,而且转化子都能够稳定遗传。农杆菌介导的遗传转化方法具有转化率高、操作简便、遗传稳定等优点,在丝状真菌的遗传转化中具有重要的意义。     

根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系

随着分子生物学研究的深入,植物功能基因组研究以及后续的大规模基因工程都必将依托于高效的植物遗传转化体系,因此植物遗传转化体系越来越成为分子生物学研究和遗传改良的重要技术基础．农杆菌介导转化法被认为是最具发展潜力的植物遗传转化方法．本文介绍了根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系．     

棉花黄萎病菌遗传转化载体构建和农杆菌转化

载体构建是建立真菌遗传转化体系的基础。本研究以pCAMBIA1305.1双元载体为基本骨架,构建棉花黄萎病菌遗传转化T-DNA质粒双元载体,通过限制性内切酶酶切、补平、连接以及去磷酸化等措施将pCAMBIA1305.1上Hygromycin抗性基因的CaMV 35S启动子替换成构巢曲霉的trpC启动子。经大肠杆菌转化后对转化子进行酶切验证,并将新构建的载体1305-3分别转入农杆菌菌株LBA4404和EHA105。为农杆菌介导的黄萎病菌遗传转化体系的建立和优化提供了存在于不同农杆菌菌株中的供试载体。     

农杆菌介导的美洲商陆抗病毒蛋白基因对非洲菊遗传转化研究

以非洲菊叶柄基部的愈伤组织为材料,通过农杆菌介导法,建立高效稳定的遗传转化体系.结果表明,OD600值为0.3的菌液浓度,侵染时间8 min,36 h的共培养,延迟筛选2 d有利于获得较高的转化效率.通过农杆菌介导,持续筛选和PCR检测,美洲商陆蛋白(PAP)基因成功转入非洲菊幼苗.     

雄性二倍体毛白杨再生体系的构建和遗传转化的研究

【目的】建立雄性二倍体毛白杨再生体系,构建稳定的遗传转化方法,为进一步研究毛白杨基因功能提供试验平台。【方法】以雄性二倍体毛白杨的幼嫩茎段和叶片为外植体,1/2 MS为基本培养基,通过调整6-BA、IAA和TDZ激素浓度进行再生体系筛选;采用农杆菌EHA105介导叶盘法,控制预培养时间、菌液浓度、侵染时间、共培养时间和卡那霉素筛选浓度,进行遗传转化;以幼嫩叶片原生质体为受体细胞,PEG介导转化荧光标记基因EGFP,进行瞬时表达。【结果】雄性二倍体毛白杨再生过程包括继代、芽伸长和生根3个阶段,其培养基组分分别为1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.005 mg/L TDZ、1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA和1/2 MS+0.3 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA,该条件下生根率为96.7%,增殖系数为4.47。遗传转化过程包括预培养、农杆菌侵染、共培养、抗性筛选和生根5个阶段,其中预培养为12 h、农杆菌浓度OD₆₀₀为0.4、侵染时间为20 min、共培养时间为24 h、卡那霉素(30 mg/L)筛选45 d和抗性苗生根20 d。试验共获得86株抗性植株,其中14株分子鉴定结果为阳性。在40% PEG4000的介导下,EGFP基因瞬间转化效率为50%。【结论】雄性二倍体毛白杨再生周期短、遗传转化稳定,是杨树基础研究的理想材料。本研究拓宽了杨树遗传转化体系,为杨树分子辅助育种提供了新途径。     

花生子叶节外植体遗传转化体系的建立

目的： 为了建立花生的高效遗传转化体系。方法：利用花生子叶节高效再生体系,以农杆菌介导法,用含有表达质粒pBOG3VP7的根癌农杆菌进行外源基因转化,优化花生的遗传转化体系。结果：通过对影响农杆菌介导的花生遗传转化的诸多因素进行的优化,试验表明：侵染菌液添加100祄ol/L AS,结合负压处理,农杆菌侵染10min,共培养3d,延后选择2w。对抗性植株进行PCR和PCR－Southern检测,11株中有6株PCR反应呈阳性,其中有3株Southern杂交有特异性目标带出现。结论：结果表明,外源基因已经整合到了花生基因组上。     

麻疯树毒蛋白(curcin)基因转化水稻的研究

以粳稻(Japonica)品种日本晴与中花11号为材料,对影响农杆菌介导水稻转化体系的几个因素进行了研究,建立了农杆菌介导的有效水稻转化体系.在该体系中,首次使用浓度为10-4g/mL嘌呤合成抑制剂acivicin在转化前对水稻愈伤组织进行预处理,结果表明此法可有效提高GUS基因的瞬时表达率.同时,利用插入了麻疯树毒蛋白(curcin)基因的植物表达质粒pBI121-curcin,通过农杆菌介导转化水稻,获得了多株转基因植株.通过PCR鉴定,证实curcin基因已整合到水稻基因组中.     

草莓的遗传转化研究进展

农杆菌介导的叶盘转化法是草莓遗传转化的主要方法．采用该方法，已成功将抗病毒、抗真菌、抗虫、抗逆境、控制果实成熟软化等方面的多种外源目的基因转入草莓．文章概述了外源目的基因转入草莓的研究进展以及基因型、农杆菌菌株、侵染时间和菌液浓度、共培养时间、酚类物质等对草莓遗传转化的影响，并对今后草莓遗传转化研究的重点提出了建议．     

农杆菌介导东方百合“西伯利亚”遗传转化体系建立

以东方百合"西伯利亚"(Lilium seberia)为材料,建立了百合再生和农杆菌介导的遗传转化体系.采用LBA4404和GV3101菌株对鳞片来源的愈伤组织进行侵染,并以鳞片作为对比转化材料,两种菌株携带有相同的双元载体pCAMBIA1301.研究结果表明,农杆菌侵染愈伤组织外植体转化率较高;乙酰丁香酮(AS)的添加能大大提高根癌农杆菌转化百合的效率.另外,共培养时间、不同菌株均对转化效率有一定的影响.筛选后获得的抗性植株经PCR检测和GUS组织化学染色证实外源基因已经整合到基因组DNA中并获得表达,转化率为5%～8%.     

两种遗传标记筛选物在马铃薯Desiree遗传转化应用中的研究

以马铃薯茎段为外植体,采用农杆菌介导法,将带有Bar和hpt基因的植物表达质粒载体转入马铃薯栽培品种Desiree,并对遗传转化过程中的预培养时间、抑菌素浓度、筛选物抗除草剂Basta和潮霉素的浓度等因素进行了研究.结果表明:预培养时间2 d转化效率最高;头孢霉素浓度为300 mg/L时,能够有效的抑制农杆菌的生长;以除草剂Basta为筛选物时,适宜的筛选压为0.6 mg/L,用潮霉素(Hyg)作为筛选物时,以15 mg/L为最合适;获得的转基因植株经PCR分析,证实Bar基因己经整合到马铃薯基因组DNA中,从而建立了以除草剂Basta或以潮霉素为遗传标记筛选物的马铃薯栽培品种Desiree的遗传转化体系,为利用基因工程进一步改良马铃薯品质奠定了基础.