人染色体17q12区带330kb范围内表达顺序的筛选

用定位于人染色体１７ｑ１２区带的长约３３０ｋｂＹＡＣ克隆５００Ｄ０９（取自法国人类多态性研究中心ＹＡＣ库）作为杂交探针，筛选人骨髓，胎脑，胎肾，骨骼肌和睾丸等五种组织的ｃＤＮＡ库（２×１０＾５～３×１０＾５ｐｆｕ／库），从中获得１０２个初级阳性克隆，初级克隆经ＰＣＲ扩增，分别与人基因组ＤＮＡ，酵母基因组ＤＮＡ和人ｒＤＮＡ探针作ｄｏｔｂｌｏｔ杂交分析，排除共中假阳性克隆后，复筛得到３２个候选克隆，对     

应用PCR—SSCP技术从显微切割的人染色体17q11—12探针池批量分离单拷贝片段的研究

将ＤＮＡ单链构象多态（ＳＳＣＰ）检测的原理，应用于“显微切割的人染色体１７ｑ１１—１２探针池”批量分离单拷贝片段，取得了很好效果。从筛选出的７４个次级单拷贝中有效地鉴定出３７个非同源的单拷贝片段。这比传统的仅限于长度比较而确认的非同源单拷贝片段（１２个）多出２５个．其中部分已经ＤＮＡ测序证实。结果提示：采用ＳＳＣＰ技术区分相似分子量单拷贝片段的同源性，可显著地提高从“显微切割探针池”分离和克隆非同源单拷贝片段的效率。本文还将一部分单拷贝片段作为探讨，与人基因组ＤＮＡ的限制性片段作Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，结果均只显示单一杂交带，说明单拷贝ＤＮＡ片段的结论是可靠的。     

Xp11.2区域YAC OAT1中表达顺序筛选

筛选X染色体XAp11.2区域的酵母人工染色体（YAC）克隆OAT1所包含的表达序列，为该区域疾病相关基因的克隆探索方法，以YAC克隆OAT1为探针，与胎脑cDNA文库的噬菌体原位烈解膜进行两轮杂交，所得的阳性克隆经地杂交鉴定除假阳性克隆和重复序列,并进行测序分析，获得了一个YAC OAT1编号的表达顺序克隆，该克隆与鸟氨酸转氨酶（Ornithine Aminotransferase,OAT)基因同源。     

人LDHA原核表达、纯化及体外抑制剂筛选模型的建立

在多数肿瘤细胞中高度表达的乳酸脱氢酶A(LDHA)与肿瘤的发生、发展和预后密切相关,筛选LDHA小分子抑制剂可提供一种富有潜力的靶向抗肿瘤策略.本研究以pET-28a为载体,构建了人LDHA表达质粒并于大肠杆菌BL21(DE3)中稳定表达,产量达到2.65mg/L.基于LDHA的催化反应建立了以丙酮酸钠和还原型烟酰胺腺嘌呤二核甘酸(NADH)为底物的筛选模型.实验结果表明:模型的LDHA最适质量浓度为60ng/mL,以质量分数0.25%草酸铵为阳性对照,筛选模型的Z因子为0.812.至此,本研究建立了LDHA抑制剂体外生化筛选模型,其成本低、可操作性强,符合高通量筛选要求,为发现新颖的LDHA抑制剂奠定了基础.     

人Cu，Zn-SOD在重组毕赤酵母中表达的发酵工艺研究

以表达人Cu,Zn-SOD的重组毕赤酵母为出发菌株,通过摇瓶实验研究发酵初始pH值、诱导剂浓度、诱导温度和培养基组成等因素对目的蛋白表达水平的影响.实验结果表明,培养基组分对目的蛋白表达水平的影响最大.与YPG培养基相比,菌株在FM22培养基(含0.15%组氨酸及PTM4)中目的蛋白表达量提高5.5倍.在优化摇瓶发酵条件下(诱导剂浓度1%,诱导温度27℃,FM22培养基(含0.15%组氨酸及PTM4),初始pH值为6.0),发酵液上清酶活水平为895 U/mL,较初始提高8.5倍;以摇瓶实验结果指导5 L罐发酵,得到13 539 U/mL酶活,为摇瓶试验的15倍.     

重组人VEGF165蛋白在毕赤酵母中高效表达与多克隆抗体的制备

构建pPIC9K-VEGF165分泌型载体,线性化后电击转化至GS115(his4)中,经最小葡萄糖培养基(MD平板)筛选出阳性表达菌株并进行聚合酶链式反应(PCR)验证.菌株发酵上清液经Sephadex G-25,Heparin Sepharose FF和Sephacryl S-100层析介质分离纯化,目的蛋白纯度达到95%,相对分子质量约为24ku.结果表明:重组人VEGF165蛋白能诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖,提高HUVEC细胞的活性;重组人VEGF165蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,间接酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测抗体效价达1:51 200.     

流加不同物质对大肠杆菌DB15(pAET-8)表达人表皮生长因子的影响

考察了在大肠杆菌DB15(pAET-8)表达人表皮生长因子(hEGF)过程中流加不同的物质——磷酸盐、蛋白胨和酵母抽提物等对人表皮生长因子表达的影响.在表达阶段单独流加磷酸盐虽然增加了表达初期的比生长速率,延长了菌体生长期,提高了菌体浓度,但hEGF产量却比对照组减少了57%.在表达阶段流加蛋白胨或酵母抽提物也未能提高hEGF的表达水平.表明氨基酸或核苷酸合成并不是hEGF表达的限速步骤,提高大肠杆菌DB15(pAET-8)合成三磷酸腺苷(ATP)的能力或许是提高hEGF表达的关键.     

深黄被孢霉Δ12-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达载体的构建

 深黄被孢霉是国内研究生产γ-亚麻酸(γ-linolenic acid,GLA)和花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)等多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid,PUFA)的主要产油丝状真菌.前期的实验结果表明,深黄被孢霉M6-22具有潮霉素抗性,而且目前也没有关于深黄被孢霉营养缺陷型菌株的报道,限制了一些基于深黄被孢霉菌株进行遗传操作的研究.研究以红色荧光蛋白DsRED基因作为报告基因,构建能同时用于丝状真菌外源基因和RNAi表达载体pS-DsRED.通过PEG/CaCl₂原生质体转化法将pS-DsRED导入深黄被孢霉M6-22中进行表达,成功获得产粉红色的阳性菌落,并在此基础上构建了深黄被孢霉Δ¹²-脂肪酸脱氢酶基因RNAi表达质粒pSREDMID12RNAi,为下一步目的基因的敲除和基因功能分析奠定了基础.     

Isolation and polymorphic frequency detection of a novel STR on human chromosome 14q24.3

A single copy fragment (FD14-ca 1) cantaining 22 CA repetitive units was isolated with (CA)₁₅ oligonucleotide probe from a human chromosome 14q24.3 probe pool generated by microdissection, and proved to be a new short tandem repeat (STR) sequence through querying in GenBank of NCBI. The STR has 11 alleles in Chinese. and its polymorphic information content (PIC) is 0.85. Mendelian segregation was shown in 2 Chinese pedigrees with two generations; This STR has been accurately relocalized on chromosome 14q24.3 by fluorescencein situ hybridization (FISH). The accession numbers of this STR in GDB and Gnknk database are D14S1435 and G31413 respectively. This STR would be able to be regarded as a novel genetic marker which can increase the genetic map accuracy in this chromosome region and improve the gene diagnosis on some genetic diseases located in chromosome 14q24.3 band.     

Isolation and identification of a novel STR (D17S2204) in the vicinity of NF1 locus

Using a synthetic oligonucleotide (dA-dC)15 as a probe to screen a probe pool made by microdissected human chromosome band 17q11-q12, a DNA fragment containing (CA)16 was isolated, which is a novel short tandem repeat (STR) determined by searching in the GenBank and GDB. It has 8 allelic types with a PIC value of 0.61. The novel STR is conformed with Mendelian segregation according to the linkage analysis of a three-generation neurofibromatosis type Ⅰ (NF1) pedigree. The STR was localized at chromosome band 17q11-q12 in the vicinity of NF1 gene by FISH analysis. The accession number of the STR in GenBank and GDB is G32112 and D17S2204 respectively.