酵母双杂交筛选血液中与PERIOD1相互作用的新蛋白

采用酵母双杂交方法,以人PER1的PAS结构域为诱饵,在人血液cDNA文库中筛选能与之相互作用的蛋白.经酶切和核苷酸序列测定,证实重组诱饵载体hper1PAS/pGBKT7构建成功.血cDNA文库转化效率为1.4×106/3μg pGADT7-Rec.酵母双杂交文库营养缺陷筛选得到114个阳性克隆,β-半乳糖苷酶检测报告基因获得46个蓝色克隆.     

人白细胞介素24蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活检测

构建人白细胞介素24蛋白酵母双杂交诱饵栽体,并检测其自激活作用.采用PCR技术特异性扩增人白细胞介素24基因IL-24,将其克隆入酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中,通过PCR扩增、限制性酶切鉴定及序列测定,获得质粒pGBKT7-IL-24.采用PEG/LiAc法将其转入酵母AH109中,经表型筛选检测其自激活作用,同时...     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(Coat Protein CP)和移动蛋白(Movement Protein MP)基因序列合成了CP，MP基因的上下游引物，通过PCR扩增获得目的片段，经过Sal I和Rst I酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序，构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP，用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白，为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒相互作用的寄主因子、克隆寄主因子，推测其种类和功能打下基础。     

酵母双杂交系统筛选与HCMV pUL23蛋白相互作用的蛋白质

将UL23基因的ORF序列克隆到酵母表达载体pGBKT7构建诱饵质粒pGBKT7-UL23,用酵母双杂交技术筛选人胚肾cDNA文库中与人巨细胞病毒pUL23相互作用的宿主蛋白分子,再通过回复酵母双杂交再次确认两者之间的相互作用.结果表明:酵母双杂交,回复酵母双杂交试验证明宿主蛋白分子elF3e(eukaryotic trans-lation initiation factor 3,subunit E interacting protein)能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用.宿主蛋白分子elF3e能够与人巨细胞病毒UL23蛋白相互作用,这为进一步研究pUL23蛋白在HCMV生活周期中的作用机制提供依据.     

酵母双杂交筛选PMEPA1互作蛋白

采用酵母双杂交技术筛选与前列腺跨膜蛋白PMEPA1相互作用的蛋白质,构建了pGBKT7-PMEPA1诱饵质粒,获得与PMEPA1互作蛋白,GST pull-down实验确定2种蛋白间的相互作用.构建了诱饵载体转化酵母菌Y2HGold,对酵母宿主无毒性、无自激活活性.得到阳性克隆Dynactin6,GST pull-down实验证实PMEPA1与Dynactin6蛋白间相互作用.推测蛋白Dynactin6可能参与调控PMEPA1在细胞的运输.     

含外显子8的prosaposin蛋白亚型与Rhox5蛋白间的相互作用

研究含外显子8的prosaposin蛋白亚型(PsapE8)与同源异型框蛋白Rhox5蛋白间的相互作用. 重叠延伸PCR法扩增PsapE8的cDNA序列,将其按照通读框方式分别克隆至pGBKT7和pGADT7酵母双杂交载体中构建pGBKT7-PsapE8和 pGADT7-PsapE8重组质粒. 酵母双杂交实验检测PsapE8与Rhox5蛋白在酵母体内的结合;体外转录翻译S35标记的PsapE8蛋白,GST pull-down实验检测PsapE8与Rhox5蛋白在体外的结合情况. 成功地构建了pGBKT7-PsapE8和 pGADT7-PsapE8重组质粒,酵母双杂交实验表明PsapE8蛋白在酵母体内可以结合Rhox5蛋白;GST pull-down实验再次验证了两者在体外的结合;表明含有外显子8的prosaposin蛋白亚型PsapE8可以与Rhox5蛋白相结合.     

酵母双杂交技术筛选与Axin相互作用的蛋白质

肿瘤抑制因子Axin以构架蛋白的形式通过Wnt、JNK、p53、TGF-β、G蛋白等众多信号转导途径参与细胞生长、增殖、分化和凋亡等多种重要细胞命运的调控过程.为了发现Axin新的相互作用蛋白,进一步研究Axin的多功能性,作者通过酵母双杂交技术,将Axin1基因从SpeI单一酶切位点到3′末端的DNA序列构建到pGBKT7载体作为诱饵,对小鼠脑的cDNA文库进行筛选,最后获得28个阳性克隆.通过对这些克隆的测序和对所得序列的生物信息学分析,得到13个与Axin的C末端相互作用的蛋白质,这些蛋白主要参与胚胎发育,肿瘤形成,蛋白翻译后修饰等生物学过程的调节.这一结果为进一步研究Axin的新功能提供了很好的线索.     

筛选hALR的相互作用蛋白基因(英)

为筛选与人肝再生增强因子(hALR)相互作用蛋白的基因,探讨肝再生增强因子在肝再生过程中的分子生物学机制,将人肝再生增强因子基因的开放读码框片断,重组入载体pGBKT7构建成“诱饵”质粒pGBKT7-hALR,然后用酵母双杂交系统从预转化酵母菌Y187的成人肝细胞cDNA文库中筛选与人肝再生增强因子相互作用蛋白的基因.筛出的阳性克隆基因序列被测出后,经GenBank查询,结果发现它们分别是血清白蛋白、金属硫蛋白、硒蛋白类似物、Na+/K+ ATPase和一个未知功能的蛋白的部分序列.这初步克隆了与hALR相互作用的蛋白基因,为进一步探讨ALR在肝再生过程中的作用机制奠定了基础.     

筛选hALR的相互作用蛋白基因

为筛选与人肝再生增强因子(hALR)相互作用蛋白的基因，探讨肝再生增强因子在肝再生过程中的分子生物学机制，将人肝再生增强因子基因的开放读码框片断，重组入载体pGBKT7构建成“诱饵”质粒pGBKT7—hALR，然后用酵母双杂交系统从预转化酵母菌Y187的成人肝细胞cDNA文库中筛选与人肝再生增强因子相互作用蛋白的基因。筛出的阳性克隆基因序列被测出后，经GenBank查询，结果发现它们分别是血清白蛋白、金属硫蛋白、硒蛋白类似物、Na^ ／K^ ATPase和一个未知功能的蛋白的部分序列。这初步克隆了与hALR相互作用的蛋白基因，为进一步探讨ALR在肝再生过程中的作用机制奠定了基础。     

利用酵母双杂交系统筛选IrrE相互作用蛋白

本研究通过酵母双杂交技术,构建了IrrE蛋白为诱饵载体,从拟南芥cDNA文库中筛选与IrrE诱饵蛋白相互作用的功能蛋白.研究结果表明,在所获得的阳性克隆中,发现了一个与拟南芥基因At1g01470所编码的蛋白有较高同源性的蛋白,即LEA14蛋白（晚期胚胎发育富集蛋白）,同源性高达98%.推测IrrE转录因子在提高植物耐盐性的过程中起了重要作用.     

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒ORF50结合蛋白的筛选

应用酵母双杂交系统,以包含RTA氮端530个氨基酸的片段插入载体pGBKT7作为诱铒,在人脾脏cDNA文库中,筛选得到4个阳性AD/文库质粒,并用酵母双杂交实验验证了阳性AD/文库质粒与RTA的相互作用.将阳性AD/文库质粒测序并对测序结果做BLAST分析,发现它们分别是:TLE2、RBP-Jk、ZNF-12和WHSC1.     

NT3的酵母双杂交诱饵载体的构建和初步鉴定

构建和转化神经营养素3(neurotrophin 3,NT3)的酵母诱饵重组质粒,为通过酵母双杂交研究NT3的功能及作用机制奠定基础。用PCR扩增NT3基因cDNA中编码完整开放读框的基因片段;将该基因片段与pLexA载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;将核苷酸序列正确的重组质粒转化入EGY48[p8op LacZ]酵母菌株。结果成功构建pLexA NT3重组质粒。转化有重组质粒和pLexA空载体的二种EGY48[p8op LacZ]酵母都能在SD Gal Raf His Ura培养基中长成白色菌落(同时,转化pLexA pos阳性对照质粒的酵母菌在相同条件下长成蓝色菌落),但都不能在SD His Leu Ura培养基中生长,在SD His Ura液中培养16h后,OD600均值均为0.8±0.1。这表明,重组质粒表达的融合蛋白没有激活LEU2和lacZ酵母报告基因表达的活性,也没有酵母毒性作用。因此,构建的诱饵重组质粒可以用于下一阶段的人胎脑cDNA文库筛选。     

无形体分泌蛋白Ats-1与宿主细胞互作蛋白筛选及其生物信息分析

目的筛选与无形体Ats-1互作的THP-1宿主细胞蛋白,为揭示病原体侵袭宿主的致病机理提供科学数据。方法利用分子克隆法构建p GBKT7-ats-1诱饵质粒并转化酵母Y2HGold,验证诱饵质粒是否有自激活、毒性现象;制备THP-1细胞c DNA并连接到p GADT7-Rec上,转化酵母Y187并鉴定c DNA文库质量;酵母双杂交筛选与Ats-1互作的宿主细胞靶蛋白,通过GO、String生物信息分析细胞靶蛋白可能的生物学过程。结果成功构建诱饵质粒;cDNA文库容量4×10~6克隆,插入片段100～3 000 bp,且无污染,达到建库质控要求;酵母双杂交结果显示,与Ats-1蛋白互作的宿主细胞靶蛋白7个,分别是真核延伸因子1复合体α1亚基(EEF1A1)、TIMP金属蛋白酶抑制子1(TIMP1)、锌指蛋白36,C3H样2 (ZFP36L2)、半乳糖凝集素1(LGALS1)、前胸腺素α(PTMA)、WBSCR22、吸引素(ATRN)。生物信息分析显示,与Ats-1互作的宿主靶蛋白主要参与细胞分化增殖、细胞凋亡、自噬、炎症等生物学过程。结论病原诱饵蛋白与宿主细胞靶蛋白互作是一种细胞-细胞间发生信号联系的分子水平生物学过程,可能影响病原粘附、侵袭及胞内生存,最终导致疾病发生及临床症状出现。     

用酵母双杂交检测BAR与PDZ结构域的相互作用

用酵母双杂交系统探索P ICK 1分子中BAR结构域与PDZ结构域的相互作用.分别构建了pGAD-PDZ和pGBK-BAR重组子,共转入酵母细胞后,涂布于SD(L eu-,T rp-,H is-)固体平板培养基,经滤纸复印和显色反应,在8 h内观察到只有pGAD-PDZ/pGBK-BAR的表达产物呈阳性,而其它对照pGADT 7/pGBKT 7、pGAD-PDZ/pGBKT 7和pGADT 7/pGBK-BAR均呈阴性反应,说明BAR与PDZ结构域具有相互作用.     

睾丸生殖细胞瘤易感基因Dnd1互作蛋白质的筛选与鉴定

小鼠睾丸生殖细胞瘤（testicular germ cell tumour,TGCT）易感基因Dnd1属于RNA结合蛋白基因家族成员．Dnd1在进化中具有保守性,Dnd1缺乏导致小鼠原始生殖细胞（primordial germcell,PGC）的丧失、TGCT的发生和部分胚胎死亡,但Dnd1作用机制还未明了．利用酵母双杂交系统,构建小鼠Dnd1基因诱饵载体pDBLeu-Dnd1,筛选10．5d的小鼠胚胎cDNA文库,成功筛选到4个与Dnd1相互作用蛋白,其中之一为原癌基因Jun蛋白;进一步的酵母双杂交实验和GST pull down实验再次确认Dnd1与Jun蛋白之间的相互作用．研究发现Dnd1新的相互作用蛋白,这为探明其信号传导通路及Dnd1致病机制研究建立了基础．     

拟南芥AtMYB44与RCAR1相互作用的研究

以拟南芥脱落酸(ABA)受体RCAR1和以文为诱饵蛋白质,利用酵母双杂交(Y2H)技术筛选出转录因子AtMYB44,本文进行了pull down及重转酵母验证,确定它们之间的关系,实验结果显示RCAR1与AtMYB44之间确实存在相互作用.此外,为了确定RCAR1在AtMYB44上的作用区域,构建了不同长度的AtMYB44cDNA序列的PGADT7载体,利用酵母双杂交实验分析,表明只有AtMYB44的N端54~105氨基酸序列与RCAR1存在相互作用.     

应用酵母双杂交系统筛选与NAP1相互作用的蛋白质

用NAP1作为"诱饵"蛋白,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,鉴定阳性克隆;再利用酵母双杂交和免疫共沉淀验证相互作用. 结果表明,通过酵母双杂交系统筛选人淋巴细胞cDNA文库,阳性克隆的鉴定,发现了与NAP1的相互作用蛋白质―蛋白酶体α亚基3(PSMA3). 免疫共沉淀(Co-IP)结果证实外源表达的NAP1蛋白和PSMA3蛋白在293T细胞中有特异性的相互作用. NAP1作为FDC分泌的一种多肽,与PSMA3有特异性的相互作用,这种相互作用如何实现对蛋白酶体降解靶蛋白的活性调节,其作用机理有待深入研究.     

肝核转录因子FOXA3相互作用蛋白的初步研究

FOM3基因足肝核转录因子（Hepatocyte Nuclear Factor,HNF）基因家族中含有Foxhead Box结构域的3个成员之一,在维持血糖平衡以及调控发育方面发挥着重要的作用,利用FOXA3-AD酵母双杂交载体筛选人肝cDNA-BD酵母双杂交文库,并通过共转化进行验证,获得了两个与NFOXA3相互作用的蛋白：C3和TMEM4．这些相互作用蛋白的发现为深入了解FOXA3蛋白参与糖代谢调控的分子机制提供了线索．     

人TCTP基因的克隆与原核表达

人翻译控制肿瘤蛋白（hTCTP）是一个在进化过程中高度保守且具有很高表达量的蛋白家族。本实验通过PCR技术扩增人hTCTP基因,经酶切后插入表达质粒pGEX-4T-2构建表达载体,转化大肠杆菌后挑选阳性菌进行菌落PCR及质粒酶切鉴定,确证克隆成功并构建了人hTCTP基因表达载体。重组表达载体经IPTG诱导表达出目的蛋白,用超声破碎、亲和层析和SDS-PAGE对目的蛋白进行了分离纯化并鉴定。     

油菜中—未知BnRCH蛋白的E3连接酶活性分析

利用本实验室前期以ATP6为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统筛选到的一个N端含有RINGv结构(RING-variant)的蛋白,暂命名为BnRCH,构建GTK-BnRCH表达载体在原核细胞E.coli BL21(DE3)中高效表达GST-BnRCH融合蛋白,并将纯化的融合蛋白加入体外泛素反应体系,发现BnRCH在ATP、泛素、E1、E2存在的条件下,能催化多聚泛素化形成,具有E3连接酶活性.