青蛤丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)基因的克隆及其在鳗弧菌胁迫下的表达分析

采用Illumina MiSeq二代测序方法筛选得到青蛤丝裂原活化蛋白激酶(MAPK/p38)基因相似序列,进一步克隆得到全长cDNA.利用荧光定量PCR技术检测该基因在青蛤各组织中以及在鳗弧菌胁迫下的组织表达特征.结果显示,该基因全长共1781bp,开放阅读框长度为1104bp,编码367个氨基酸.在正常条件下该基因在青蛤体各组织中都表达,其中血淋巴中表达量最高,肝脏次之,鳃中最少.经菌液侵染后12h青蛤血淋巴中表达量即达到峰值,随后表达量逐渐降为正常水平.     

人亲环素基因的克隆、表达及应用研究

亲环素(CyP)具有多种生物学功能,它是CsA的胞内受体,能和CsA特异结合;它又是人类免疫缺陷病毒(HIV)在细胞内复制的必要因子.研究首先从动物组织中提取、纯化CyP蛋白,并且克隆了CyPA基因,在Ecoli中获得高效表达.进而又克隆、表达了CyPB基因,进行了生物学活性测定,制备了CyP蛋白单克隆抗体和多抗,建立了多项检测方法.研制的CyP自身抗体及CsA血药浓度两种检测药盒已在临床应用,已取得良好的效益.     

蜡梅亲免素基因CpFKBP 的克隆与表达分析

在已构建好的蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础上,随机克隆测序得到一个蜡梅FKBP基因,将其命名为CpFKBP,Genebank登录号:JQ337962.该基因cDNA长为482bp,具有一个339bp的ORF,编码一个113个氨基酸的多肽,预测等电点为8.48,理论分子量为12.08KD.在大肠杆菌中获得并纯化了重组的CpFKBP蛋白质,并进一步对重组蛋白进行PPIase活性分析,结果显示CpFKBP重组蛋白有较高的PPIase酶活性.     

昆虫致病性斯氏线虫亲环素基因的克隆、特征及表达分析(英文)

亲环蛋白(Cyclophilin)广泛存在于原核和真核生物中,在进化过程中结构保守,多数具有肽基脯氨酰基顺反异构酶活性。本文在斯氏线虫(Steinernema carpocapsae)差减杂交分析的基础上,克隆一个亲环蛋白基因(Sca-CYN)。该胞质蛋白有171个氨基酸组成,分子量约为16.2kD,等电点约为6.89。BLAST分析表明,Sca-CYN蛋白与线虫、昆虫及其它生物亲环蛋白的序列一致性达75%~89%。基因表达分析显示该基因在寄生初期就上调表达。序列比较及进化标记分析发现Sca-CYN为秀丽隐杆线虫亲环蛋白3的直系同源蛋白。同源建模分析显示该蛋白具有亲环蛋白的经典三维结构。系统发育分析结果表明该蛋白在进化早期与其同源基因分离。研究结果为进一步研究该基因功能及探讨线虫亲环蛋白基因家族的分子进化提供基础。     

仿刺参硫氧还蛋白基因在灿烂弧菌和鳗弧菌刺激下的应激表达特征

分别用灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和鳗弧菌(V.anguillarum)对仿刺参(Apostichopus japonicus)进行注射感染试验,取注射后0、3、6、9、12、24 h的仿刺参体壁、肠道、呼吸树、触手和体腔细胞5种组织或细胞进行了实时荧光定量PCR检测,分析硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx)基因在这5种组织或细胞中的表达特征,探讨了硫氧还蛋白在仿刺参先天免疫中的作用。结果显示,Trx基因在仿刺参体壁、肠道、触手、呼吸树及体腔细胞中均表达;在灿烂弧菌刺激下各组织或细胞中Trx基因变化趋势相似,呈现一种"突增-下降-再突增"的双峰型模式;鳗弧菌刺激下Trx基因表达量变化同样呈现先升高后降低的趋势,但与灿烂弧菌组相比反应时间与上调幅度都不同。总而言之,Trx基因在仿刺参体内有组成型和诱导型两种表达模式,并存在表达的组织特异性和病原特异性;Trx基因参与了仿刺参对病原感染的免疫应答,使机体免受氧化胁迫,在抵御外界病原入侵、维持胞内氧化还原状态方面起到重要作用。     

昆虫致病性斯氏线虫亲环素基因的克隆、特征及表达分析

亲环蛋白(Cyclophilin)广泛存在于原核和真核生物中,在进化过程中结构保守,多数具有肽基脯氨酰基顺反异构酶活性。本文在斯氏线虫(Steinernema car poca psae)差减杂交分析的基础上,克隆一个亲环蛋白基因(Sca-CYN)。该胞质蛋白有171个氨基酸组成,分子量约为16.2kD,等电点约为6.89。BLAST分析表明,Sca-CYN蛋白与线虫、昆虫及其它生物亲环蛋白的序列一致性达75%~89%。基因表达分析显示该基因在寄生初期就上调表达。序列比较及进化标记分析发现Sca-CYN为秀丽隐杆线虫亲环蛋白3的直系同源蛋白。同源建模分析显示该蛋白具有亲环蛋白的经典三维结构。系统发育分析结果表明该蛋白在进化早期与其同源基因分离。研究结果为进一步研究该基因功能及探讨线虫亲环蛋白基因家族的分子进化提供基础。
     

低盐刺激下副溶血弧菌基因转录表达分析

目的:应用全基因组DNA芯片技术分析低盐冷刺激作用下副溶血弧菌基因的转录表达变化.方法:分别采用"低盐持续刺激培养(continuous growth,CTG)"和"中间转入低盐环境培养(shift growth,STG)".CTG和STG下.分别采用含NaCl浓度为2%和0.66%的MV-5培养基孵育副溶血弧菌,收集菌体,提取RNA,应用全基因组DNA芯片分别比较两个不同的转录表达谱基因变化特点,分析其作用规律.同时,应用实时定量逆转录多聚酶联反应对芯片结果进行验证.结果:和对照组相比,STG实验中,共有205个基因的转录表达发生显著性变化,上调的基因占优势地位;CTG实验中,总计有298个基因的转录表达发生显著性变化,上、下涮的基因总体基本趋于平衡状态,没有明显差异.实时定量逆转录多聚酶联反应结果证实其和芯片数据结果有很强的相关性.结论:在低盐这一"胁迫环境"下,副溶血弧菌利用其存在的独特而精细的应对机制,能够顽强的生存下来并繁衍生殖,这一过程中,节能调节处于调控的核心地位.     

冷刺激下副溶血弧菌基因转录表达变化分析

目的:应用全基因组DNA芯片技术分析从37℃转入10℃后冷刺激作用下副溶血弧菌基因转录表达变化。方法:10℃低温分别作用于副溶血弧菌20、40和60min后,收集以上3个时间点和正常对照组的菌体,提取RNA,进行一个连续的时相分析。在每一个时间点的细菌基因表达分别与对照组(冷处理前37℃生长状态)相比较,获取每个时间点和正常对照组的基因转录表达上下调的倍数或者其对数值,以荧光信号的变化倍数值为2作为一个临界点,结合SAM分析软件选取基因变化倍数较大的数值。结果:在冷刺激后20、40、60min3个时间点可以检测到大量的转录水平发生明显变化的基因,对于这些发生变化的基因,根据各个时间点的变化规律,进行了分簇归类分析,共分为9簇,每一个簇都存在一种独特的时间依赖的表达模式。在每个相关的时间点,代谢相关的基因以下调为主。面对突然而急剧的温度变化,细胞膜相关的代谢基因发生了明显的重塑。结论:通过对体外低温环境下副溶血弧菌的比较转录谱分析,得到了在低温条件下基因转录发生明显变化的细胞代谢和毒力因子等相关基因,为副溶血弧菌基因转录调控网络的研究提供了一定的理论依据。     

猪亲环素18的基因克隆与融合蛋白的表达

亲环素18(CyP18)具有肽脯氨酰顺/反异构酶活性,广泛存在于不同物种中,是一种高度保守的蛋白质.它能和免疫抑制性药物环孢菌素A结合,参与免疫抑制;此外,作为分子伴侣,它还加速蛋白质的折叠、组装和分解.从猪肝中提取总RNA,首次通过RT-PCR扩增出pCyP18,对其基因进行克隆和序列测定,并转入腚大肠杆菌中进行高效表达,得到纯化的pCyP18蛋白.     

人亲环素A单克隆抗体的制备及鉴定

制备人亲环素Ａ特异性单克隆抗体并鉴定其特性。方法：利用基因重组技术大量表达人亲环素Ａ蛋白,纯化后作为抗原免疫的ＢＡＢＬ／ｃ小鼠,经细胞融合和筛选,制备特异单克隆抗体。结果和结论;共建立三株稳定分泌抗人ＣｙＰＡ的杂交瘤细胞株,其所产生的单克隆抗体均为ＩｇＭ型,轻链为ｋ。     

副溶血弧菌VopS效应子基因的克隆与原核表达

副溶血弧菌可通过Ⅲ型分泌系统分泌效应毒力蛋白导致真核靶细胞的细胞溶解及细胞凋亡.VopS是Ⅲ型分泌系统中的一个效应毒力因子,能通过抑制NF-κB的活性介导巨噬细胞死亡.实验将效应因子VopS的编码基因克隆到pET28a(+)载体上,成功构建了pET28a(+)-vopS重组质粒,将该质粒转入大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,经SDS-PAGE分析,发现在分子量约为43 kDa处有一明显蛋白表达条带.用Ni2+-NTA柱亲和层析获得纯化蛋白,浓度为175 mg/L.为进一步研究副溶血弧菌Ⅲ型分泌系统致病机制提供了材料.     

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)FlaI基因的合成及其克隆与鉴定

根据副溶血弧菌野生型菌株BB22 FlaI基因cDNA序列,通过合理的引物设计、链延伸反应、PCR反应以及分子克隆等技术,成功地合成出编码极鞭毛蛋白的FlaI基因全长片段,并将其克隆至pMD18-T载体质粒上.序列分析和酶切鉴定显示FlaI基因得到了正确的合成和克隆.     

黄姑鱼(Nibea albiflora)gsdf基因的克隆及表达分析

为探索gsdf(gonadal soma derived factor)基因对黄姑鱼性别分化和性腺发育的作用,克隆了黄姑鱼gsdf基因ORF序列全长,并运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测了该基因在黄姑鱼不同组织和不同发育时期性腺中的表达情况。结果显示:黄姑鱼gsdf基因开放阅读框长648 bp,可编码215个氨基酸,含有TGF-β超家族的保守功能结构域;组织表达分析结果显示,黄姑鱼gsdf基因主要集中在精巢中表达;在23℃左右水温下,孵化后40 d的遗传雄性鱼苗性腺中开始检测到gsdf基因有明显表达(此时组织学上尚看不出精巢形态),49 d后表达量迅速升高,孵化120 d后(精巢分化完成)表达量达到高峰,随后表达量开始下降,直到黄姑鱼精巢成熟之后呈现稳定表达。上述结果提示,黄姑鱼gsdf基因与黄姑鱼性别决定和分化发育过程密切相关。     

青稞脱水素基因dhn4的克隆与原核表达

用RT-PCR的方法从重要的高原作物青稞(Hordeum vulgare L.vat.nudum Hook.f.)中克隆到了脱水素基因dhn4,其编码区长为678 bp,所编码的蛋白质DHN4为YSK2型脱水素.经预测,该蛋白二级结构易形成α-螺旋,并无固定的三级结构.将dhn4基因cDNA编码区定向克隆到载体PEW30-c上,获得了重组质粒PET-dhn4,该重组质粒再转化到大肠杆菌BL21茵株,37℃经1.5 mmol/L IPTG诱导获得了大量分子量约为35 kD的融合蛋白.然后用亲和层析的方法对该蛋白进行纯化,得到了纯化的脱水素DHN4蛋白.     

甘蓝型油菜植物防御素基因的克隆与原核表达

根据Genbank上已知的植物防御素基因设计引物,以甘蓝型油菜中的品种”蜀杂九号”种子总RNA反转录成的eDNA为模板,进行PCR扩增,获得了243bp的片段．将该片段回收。连接到pMD18-T载体测序,将测序片段经酶切回收后克隆到GTK表达载体中,在0．1mmol IPTG诱导下表达出与理论值相符的34kD的融合蛋白条带,用GST单克隆抗体做第一抗体进行Western-blot检测,获得阳性结果,这为甘蓝型油菜植物防御素基因功能的进一步研究提供了基础．     

鲢(Hypophthalmichthys molitrix)IL-10基因的克隆及表达分析

白细胞介素10(IL-10)是一种作用广泛的抗炎细胞因子,主要功能是限制和最终终止炎症反应.用RACE(rapid amplification of cDNA ends)-PCR方法扩增出鲢白细胞介素10(IL-10)的cDNA,其全长为1248nt,包含5'非编码区156nt,3'非编码区552nt,开放阅读框540nt.鲢IL-10的开放阅读框编码179个氨基酸,其中包含构成两对二硫键的4个保守半胱氨酸.RT-PCR结果显示鲢IL-10mRNA主要在脾脏、鳃、头肾和肌肉中表达.将鲢IL-10完整开放阅读框克隆到原核融合表达载体pET-32a-c(+)上,转入大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)内进行表达,经SDS-PAGE电泳后显示重组融合蛋白在分子量约39 ku处有明显表达带,与预期分子量大小一致,且主要以不可溶的包涵体形式存在.变性条件下利用His·Bind树脂成功纯化了融合蛋白,将其免疫家兔,获得兔多克隆抗鲢IL-10抗体,Western blot检测到兔多克隆抗鲢IL-10抗体可有效地与重组蛋白结合.这些结果为进一步研究IL-10的功能奠定了基础.     

盐地碱蓬甲硫氨酸合成酶基因(SsMS)的克隆与表达分析

从盐地碱蓬 (Suaedasalsa)中克隆了甲硫氨酸合成酶基因的cDNA片段 .通过Southern杂交和Northern杂交对其表达特性进行分析 ,结果表明 ,同一盐浓度不同时间处理下、双氧水及冷害刺激条件下甲硫氨酸合成酶在碱蓬叶中的表达量先呈现减少然后增加的趋势 ;聚乙二醇 (PEG)透导下呈现下降趋势 .由此可见该酶在盐、氧化和低温胁迫条件下产生一定的反应 .     

溶藻弧菌TssJ基因的原核表达及多克隆抗体制备

Tss J是溶藻弧菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)的一个重要基因.为了制备Tss J基因的多克隆抗体,以溶藻弧菌HN08155菌株的DNA为模板,扩增Tss J基因后利用表达载体PET-32a(+)和大肠杆菌BL21(DE3)原核表达,分离纯化后免疫大鼠获得Tss J基因的多克隆抗体.结果显示,37℃、IPTG终浓度1 mmol·L~(-1)是较适宜的表达诱导条件,表达的融合蛋白是存在于细胞内的包涵体,与预期的分子量42 k D一致,并且免疫大鼠后血清的多克隆抗体效价很高,为1∶32 768.制备的溶藻弧菌Tss J高效价多克隆抗体有助于进一步开展Tss J的定位和功能研究.     

β-琼脂糖酶(AgaA7)基因的克隆与表达

为研究重组β琼脂糖酶(AgaA7)基因的表达产物及其生物活性,根据GeneBank中β琼脂糖酶(AgaA7)基因的编码序列合成此基因后,将其克隆到表达载体PQE30中,测序结果证明合成基因序列正确,未改变读码框.然后将此表达载体转入E.coli M15中进行诱导表达.纯化后的表达产物经SDS-PAGE检测其相对分子质量并鉴定其生物活性.结果表明:其相对分子质量约为5.0×104,与预期相符,具有生物活性.     

人源温和气单胞菌溶血素基因的克隆与表达

根据GenBank报道的人源温和气单胞菌溶血素(hly)基因序列设计引物,经PCR扩增,得到大小约为1470bp的阳性产物.利用BamHⅠ,HindⅢ位点将hly基因片段克隆到pMD19-T载体,构建得到重组质粒pWT-hly,并比较所克隆基因序列的同源性.然后将该基因克隆到原核表达载体pET-28a,构建原核重组表达质粒pWET-hly,转化BL21(DE3)并进行SDS-PAGE分析.结果表明:克隆的hly基因与GenBank报道的溶血素基因同源性为96.19%;重组菌株经IPTG诱导后,hly基因得到了高效表达.