家蚕重要经济性状基因分子标记定位及克隆研究

江苏大学主持的“家蚕重要经济性状基因分子标记定位及克隆研究”日前通过省科技厅组织的鉴定．该研究报道家蚕抗核型多角体病毒(NPV)、耐氟化物、多产卵、荧光茧色4类经济性状的分子标记；在家蚕上发现抗DNV相关基因BmPKCI(AY860960)、抗NPV相关基因s3a(AY705974)、感NPV相关基因BmSOP2(AY763110)，同时，建立了家蚕分子标记辅助育种技术体系，2003年-2004年经过4个省实验室鉴定及安徽省3个农村点饲养，茧质、丝质良好。     

柞蚕核型多角体病毒fgf基因的克隆和分析

为获得柞蚕NPV的全基因组序列，在柞蚕尸体中分离纯化柞蚕NPV，提取其基因组DNA，分别建立ApNPV DNA的HindⅢ和SalⅠ基因文库．对插入片段进行测序，经过同源性分析发现一个与人源fgf基因相似的基因，其读码框含有185aa．核苷酸和氨基酸同源性比较的结果表明：在genebank中没有同源性极高的序列，是个新基因；柞蚕NPV的fgf基因与云杉卷叶蛾NPV的同源性较高，分别为56．1％和45．9％，而与家蚕NPV及AcNPV的同源性相对较低，说明柞蚕NPV与家蚕NPV在进化上亲缘关系较远．该基因的克隆为进一步研究其在病毒感染过程中的作用打下基础．     

花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis)黑腐病抗性基因同源序列分离及克隆的研究

通过从NBS保守序列设计简并引物PCR的方法，以花椰菜（Brassica oleracea var．botrytis）抗、感黑腐病的近等基因系为材料，分离得到NBS-LRR型抗性基因同源序列，并获得1个克隆，命名为RGA330—7．Southern杂交表明，该片段在近等基因系中存在明显的多态性，且该片段在抗黑腐病基因位点至少存在3个以上类似RGA330—7的同源拷贝．序列分析结果认为该克隆与NBS—LRR型抗性基因的部分CDSs有很高的同源性，说明该片段属于NBS—LRR型．系统进化分析该序列与甘蓝型油菜的2个抗病同源序列归为一类，很可能这3个不同来源的抗性基因同源序列同属于一种抗性基因家族．因此推测该序列与花椰菜抗黑腐病基因紧密相关，为进一步克隆花椰菜抗黑腐病基因提供了可靠的候选基因，对分子标记辅助抗性育种具有重要意义。     

利用AFLP-银染法筛选与抗甘蓝黑腐病性状连锁的分子标记

利用ＡＦＬＰ－银染法在一对花椰菜抗、感黑腐病的近等基因系中筛选到四个与抗黑腐病性状、一个与感黑腐病性状连锁的ＤＮＡ 分子标记．对其中一个４００ｂｐ 的抗病标记进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交检测,结果表明该标记在抗病品系中存在明显的杂交信号,而在感病品系中无杂交信号．该标记测序后,通过Ｇｅｎｂａｎｋ 进行同源性检测,发现其与拟南芥菜ＢＡＣ克隆Ｆ７Ｎ２２ 部分序列有７５％ 的同源性．该ＢＡＣ克隆位于拟南芥菜５ 号染色体的黑腐病抗性基因（ｒｘｃ２）附近．这意味着该标记可能与甘蓝黑腐病抗性基因紧密连锁．     

普通小麦Brock中一个抗白粉病新基因AFLP标记P13/M13250的筛选

用225对AFLP引物组合，对白粉病敏感小麦品种京411，抗病品种Brock和以京411为轮回亲本、Brock为抗源供体育成的近等基因系（NILs）进行分子标记筛选，其中，引物组合P13／M13能在抗、感材料间稳定产生P13／M13-250bp的多态性片段．用Brock与京411杂交R代抗、感分离单株，对P13／M13 250进行了初步连锁性鉴定，该标记对小麦植物抗病育种分子标记辅助选择有一定用处．     

高粱抗丝黑穗病SCAR标记的建立

选用高粱丝黑穗病感病恢复系矮四、抗病恢复系2381R以及二者F2代抗感个体为试验试材,采用CTAB法提取高粱基因组DNA,并应用RAPD筛选技术对高粱基因进行分子标记,选取了100对RAPD随机引物对其进行扩增,有88对引物扩增出条带。分析结果表明:88对引物中S_(405)在抗感品种间扩增出差异谱带。进一步对抗感群体进行分离分析,得出抗丝黑穗病基因重组率为11.7%。将S_(405)扩增出的差异片段进行克隆测序,差异谱带的片段长度为320bp。根据差异谱带的碱基排列顺序,设计特异性引物,然后进行序列扩增,将RAPD分子标记转化为SCAR分子标记,并将该标记命名为S_(405-320),为高粱优良品种的筛选和培育奠定一定的基础。     

白肋烟遗传连锁图的构建及黑胫病抗性QTL初步分析

利用白肋烟抗黑胫病品种B37（Burley37）和感黑胫病品种B67（Burley67）杂交的F1代以花药培养技术培养获得的双单倍体（DoubleHaploid,DH）遗传群体87个株系为作图群体,利用AFLP和SRAP分子标记技术,在群体中共获得135个多态性标记．以此为基础,利用Mapmaker／EXP作图软件,构建了一个含23个连锁群、99个标记的白肋烟遗传连锁图,该图谱总长为915．7cM,标记间的平均距离为9．2cM．同时利用两年田间试验调查分析了该群体各株系的黑胫病发病率和病情指数,利用WinQTLcart2．5软件扫描遗传连锁图,在4个连锁群上共检测到7个黑胫病抗性相关QTLs（QualitativeTrairLoci）,分别命名为TBS1一TBS7,单个QTL解释表型变异11．2％--20．0％．其中在C2和C5两个连锁群上出现了重复性稳定的QTL研究结果为精细定位抗病QTL以及通过分子标记辅助选择等方法选育黑胫病抗性强的烟草品种奠定了基础．     

家蚕生物反应器与家蚕实验动物化饲育技术

以家蚕为生物反应器 (重组家蚕核型多角体病毒表达系统 )生产基因工程产品 ,具有成本低、安全、产品产量与活性高的优点。随着近年生命科学和生物技术的迅猛发展 ,需要发展新的实验动物品种、特别是利用低等动物代替哺乳动物 ,大力开发动物资源型功能 ,造福人类。本文报道我所利用家蚕表达外源基因与家蚕实验动物化饲育技术方面一些研究成果。由家蚕细胞、转移载体、修饰的BmNPV、家蚕幼虫或蛹组成家蚕表达系统。获得了含有日本血吸虫脂肪酸结合蛋白基因的重组病毒 (rsj14NPV)和含有日本血吸虫 2 8KDGST基因的重组病毒 (rsj2 8NPV)。r…     

水稻抗条纹叶枯病分子标记在不同品种中的扩增比较

以感水稻条纹叶枯病品种＂日本晴＂、高抗品种＂kasalath＂以及14个目前在我国长三角地区水稻生产中被认为在抵抗条纹叶枯病方面具有较好效果的水稻品种为材料,分析比较了14对分子标记引物扩增16个水稻品种基因组获得的DNA产物.结果显示：在14对分子标记引物中,有8对在扩增感病品种＂日本晴＂和高抗品种＂Kasalath＂水稻基因组时可获得多态性条带.因此推断这8个标记可在以这两个品种为亲本的抗条纹叶枯病选育中使用;并且,本研究结果还将为利用本试验收集的14个水稻品种为亲本的分子标记辅助育种提供重要的背景信息.     

白肋烟遗传连锁图的构建及黑胫病抗性QTL初步分析

利用白肋烟抗黑胫病品种B37(Burley37)和感黑胫病品种B67(Burlcy67)杂交的F1代以花药培养技术培养获得的双单倍体(Doublc Haploid,DH)遗传群体87个株系为作图群体,利用AFLP和SRAP分子标记技术,在群体中共获得135个多态性标记. 以此为基础,利用Mapmakcr/EXP作图软件,构建了一个含23个连锁群、99个标记的白肋烟遗传连锁图,该图谱总长为915.7 cM,标记问的平均距离为9.2 cM.同时利用两年田间试验调查分析了该群体各株系的黑胫病发病率和病情指数,利用WinQTLcart2.5软件扫描遗传连锁图,在4个连锁群上共检测到7个黑胫病抗性相关QTLs(Qualitative Trait Loci),分别命名为TBS1-TBS7,单个QTL解释表型变异11.2%-20.0%.其中在C2和C5两个连锁群上出现了重复性稳定的QTL.研究结果为精细定位抗病QTL以及通过分子标记辅助选择等方法选育黑胫病抗性强的烟草品种奠定了基础.     

RAPD技术在实验动物中的应用

随着生物医学的发展 ,实验动物种质资源的保护和利用、实验动物的标准化问题已成为当今实验动物科学发展的主题。实验动物遗传背景分析、品种或品系的鉴定、引种和繁育均需要一定的遗传标记辅助完成 ,分子遗传标记作为一种有效精确的监测手段 ,突破了形态学标记、细胞学标记和同功酶标记等表达型标记的局限性 ,可以从分子水平揭示物种的遗传变异 ,在许多领域发挥着独特的作用。RAPD技术是 1990年被首次提出 ,由于该方法具有简便、快速、成本低、信息含量丰富等特点 ,在生物类群种属分类鉴定、遗传图谱构建、物种亲缘关系的确定以及种群遗…     

高粱抗丝黑穗病基因的分子标记RAPD分析

丝黑穗病是影响我国高粱生产发展的主要病害之一,在高粱产区每年都有发生,发病率有时高达70 %,给生产造成很大损失,而选育抗病品种是最为有效的抗病策略.分别以高粱2381恢复系(抗病)、矮四恢复系(感病)的叶片为试材,采用CTAB法提取高粱基因组DNA,并应用RAPD筛选技术对高粱基因进行分子标记.在最佳的RAPD反应体系中共筛选了100个RAPD随机引物,筛选出来27个适宜引物,获得了稳定的RAPD扩增结果及多态性较好的DNA谱带.其中有6个引物对DNA扩增产生了差异谱带.     

Inheritance of resistance to race 7 of Cercospora sojina in soybeans and RAPD tagging of the resistance gene

Frog-eye leaf spot of soybean caused by Cercospora sojina Hara is a kind of worldwide disease. Resistance to race 7 of C. sojina was found to be due to a single dominant gene through analyzing resistant behavior of the cross NEAU91212 (susceptible to race 7) × NEAU9674 (resistant to all races). 3 RAPD markers linked to the resistant gene Rcsc 7 were identified using the BSA method. 2 fragments of OPS03620 and OPS03580 amplified with primer OPS03 co-dominantly segregated in the F2 individuals. The genetic distance between OPS03620 and the resistant gene is 8.7 cM. According to the co-dominant marker, the accuracy of predicting the homozygous and heterozygous resistant F2 individuals were 100% and 97.6% , respectively.     

Characterization and molecular marker screening of a rice bacteria-resistant gene Xa-min(t)

To test the resistant spectrum of the Xa-min(t) gene introgressed from Oryza minuta, thirty-four isolates of different bacterial blight pathogen, Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), from 11 countries were used to inoculate the Xa-min(t) introgression line 78-15. Four rice cultivars, IR24, C64 (IRBB21), Nipponbare and Zhonghua 11 were used as controls. The results showed that the Xa-min(t) gene was broad-spectrum and highly resistant to diverse Xoo isolates. The methods of bulk segregant analysis (BSA), randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) and sequence characterized amplified regions (SCAR) were used to analyze F2 individuals of the hybrid IR24×78-15 and molecular genetic markers linked to Xa-min(t) gene were identified. A total of 800 arbitrary decamer oligonucleotide primers were used for RAPD analysis. Two RAPD markers, BE05300 and BE061400, produced by primers BE05 and BE06 respectively, were closely linked to the Xa-min(t) gene. Based on the sequences of these two markers, sequence specific primers were designed and used to screen all F2 plants. One RAPD marker, BE05300, was converted into a stable SCAR marker (ScBE05300). Linkage analysis was carried out using markers ScBE05300 and BE061400 on 948 and 719 F2 individuals of the hybrid IR24×78-15. Our results indicate that the genetic distances from Xa-min(t) to ScBE05300 and BE061400 are 2.2 cM and 3.7 cM respectively on the same side. This study may facilitate the construction of the fine physical map of the Xa-min(t) gene.     

水稻苯达松敏感致死基因的RAPD标记的克隆及测序

用3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit试剂盒将与水稻苯达松敏感致死基因相连锁的RAPD遗传标记S20—420和S316—600回收纯化，连接于pGEM—T载体并克隆测序，得到了S20—420和S316—600的全序列，其长度分别为423bp、606bp．将两端序列设计特异PCR扩增引物可用于检测水稻苯达松敏感致死基因和标记辅助育种．     

复发性外阴阴道假丝酵母菌病菌种分子分类与药敏的研究

目的探讨临床分离酵母菌分子分类方法和药物敏感性特征.方法临床收集复发性外阴阴道假丝酵母菌病的93株酵母菌,应用法国生物梅里埃酵母菌药敏试剂盒ATBTMFUNGUS3进行体外药物敏感性试验,以核糖体基因26S rDNA D1/D2区的序列分析为依据研究其菌种的分子分类方法.结果 93株酵母菌分为光滑假丝酵母菌（38/93）、白色假丝酵母菌（23/93）、近平滑假丝酵母菌（16/93）、似平滑假丝酵母菌（9/93）等9个种11个基因型.其中有18株为敏感株,3株完全耐药.5种常用抗真菌药物的敏感性是5FC 83.87%,AMB 93.55%,FCA 27.96%,ITR 21.51%,VRC 43.01%.结论基于核糖体基因的分子分类法可以准确鉴定酵母菌临床分离株,复发性外阴阴道假丝酵母菌病菌种呈现以光滑假丝酵母菌为主的非白色假丝酵母菌占75.27%的分布特征.93株酵母菌对AMB,5FC的敏感性高于三唑类药物,三唑类药物中ITR耐药率高于VRC,FCA.药物敏感性与菌种有关.     

中国栗属特有种保守RAPD片段分析

利用RAPDDNA分子标记技术研究了栗属特有种(板栗、茅栗和锥栗)特异保守片段。结果表明，从520多个随机引物中筛选出有扩增产物，且多态性丰富的10个引物，其中引物B08(GTCCACACGG)分别在所有供试的板栗、茅栗和锥栗中均扩增出各自特异的DNA片段，其片段大小分别为2050，900和1500bp。这些DNA片段在种水平上的高度保守性，可以用来区分这3个种。此次研究结果同时也说明RAPD标记是鉴别近缘种的理想工具。     

几种中国栽培灵芝品种的RAPD及rDNA分子标记鉴定

以常见几种中国栽培灵芝菌株为研究材料,运用RAPD、18SrDNA和ITS 3种分子标记来分析各灵芝菌株之间的亲缘关系,同时比较3种分析结果,探索适于灵芝属研究的技术方法。RAPD分析结果表明,6种菌株在相似性系数为0.584的水平上聚为3类:Ganodermaluidun、GanodermaluidumHG、Ganodermasinenses和Ganodermaatrum为一类;Xuezhi和Coriolusversicolor各单归为一类。ITS分析结果显示,灵芝菌株间相似性较低(43.8%～88.0%),其中Ganodermasinenses和Xuezhi的相似性为43.8%,在较低相似性水平上,Ganodermaluidun和Ganodermasinenses归为一类,Coriolusversicolor和Xuezhi各单归为一类,这与RAPD分析结果一致,也与传统分类结果基本一致。18SrDNA分子标记显示的结果与前两种分析结果有很大差异,说明18SrDNA分子标记并不适合灵芝属的分类研究。     

Production of human alpha-interferon in silkworm using a baculovirus vector

Microorganisms are generally used for mass production of foreign gene products, but multicellular organisms such as plants have been proposed as an economical alternative. The silkworm may be useful in this context as it can be cultured easily and at low cost. We have therefore developed a virus vector to introduce foreign genes, for example, the gene for human alpha-interferon (IFN-alpha), into silkworms. We used the baculovirus Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus (BmNPV) which has a large (greater than 100 kilobases, kb) double-stranded circular DNA genome within its rod-shaped capsid. Baculoviruses have been used previously as vectors for expression of beta-interferon and beta-galactosidase in established cell lines. Although BmNPV has not been used previously as an expression vector, it has an advantage over the baculovirus Autographa californica NPV in that it has a narrower host range and will not grow in wild insect pests in the field. In the present study, the polyhedrin gene encoding the major inclusion body protein of BmNPV was identified by hybridization with complementary DNA and cloned in a plasmid. For insertion of foreign genes, we constructed a recombinant plasmid carrying a polylinker linked to the promoter of the polyhedrin gene, and inserted the IFN-alpha gene into this plasmid. The resulting plasmid and the BmNPV genomic DNA were co-transfected into BM-N cells, and stable recombinant viruses isolated by plaque assay on BM-N cells. The recombinant virus replicated in silkworm larvae, which synthesized as much as 5 X 10(7) units (approximately 50 micrograms) of interferon in their haemolymph.     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.