活性污泥宏基因组Fosmid文库的构建

大插入片段宏基因组文库的构建是开发大片段目的基因及分析其结构与功能的基础.文中分别采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法、试剂盒及琼脂糖包埋法提取活性污泥宏基因组DNA,其中琼脂糖包埋法获得的DNA片段大于23kbp,利用此DNA成功构建了以pCC1FOS为载体的Fosmid文库,该文库含有5280个克隆,平均插入片段长度为35～40 kbp,共包含约200 Mbp的宏基因组DNA.从此文库中随机挑选200个克隆,利用活性筛选方法快速筛选到了1个含有淀粉酶的阳性克隆,表明活性污泥Fosmid文库可用于功能基因的活性筛选,具有开发新基因的潜力.     

宏基因组技术在环境微生物资源开发中应用的探索

环境中约有99%的微生物在现有的条件下不能被培养,这使微生物资源的开发利用受到了限制.宏基因组是指某一特定的环境中全部微生物的总DNA,宏基因组技术是将样品中的总DNA提取出来后,利用适宜的载体克隆到宿主细胞中以构建成宏基因组文库,再筛选新的活性物质或基因,该技术在微生物资源的开发利用上将会有巨大的发展潜力.     

温泉菌宏基因组文库的构建

为克隆温泉菌中耐热的新型木聚糖酶基因,通过提取未培养即墨温泉样品的基因组DNA,剪切并末端平头化后,用pUC18质粒为载体连接转化大肠杆菌,构建了一个包括1.2×105左右克隆的宏基因组文库.文库中外源DNA总容量约为3.0×105kb,文库中插入所需大小片段的成功率达87%.     

堆肥未培养细菌的宏基因组文库构建及新的木聚糖酶基因的克隆和鉴定

从自制堆肥样品中提取未培养细菌的总DNA,用柯斯质粒pW EB∷TNC为载体构建宏基因组文库,对文库进行筛选获得表达木聚糖酶活性的克隆,再进行亚克隆、测序分析以及B lastx搜索G enB ank分析木聚糖酶基因。结果构建得到一个包含约5万个克隆的宏基因组文库,文库中外源DNA总容量约为1.8×106kb,获得2个表达木聚糖酶活性的克隆:pGXN 1050和pGXN 1051,鉴定分析表明:pGXN 1050上潜在的木聚糖酶基因um xyn 11A具1个771bp的ORF(Open R ead ing F ram e),可编码含257个氨基酸的蛋白质,所编码产物与混合纤维弧菌(C ellv ibr io m ix tus)的内切-1,4-β-木聚糖酶(G enB ank索引号Z48925.1)的氨基酸序列有46%的一致性和57%的相似性;pGXN 1051上潜在的木聚糖酶基因um xyn 11B具一个723bp的ORF,可编码含241个氨基酸的蛋白质,编码产物与混合纤维弧菌的内切-1,4-β-木聚糖酶(G enB ank索引号Z48925.1)的氨基酸序列有73%的一致性和80%的相似性。木聚糖酶Um xyn11A和Um xyn11B都属于糖基水解酶家族11的成员。     

宏基因组技术及其在厌氧消化研究中的应用

在介绍基因（组）富集、基因（组）DNA提取、文库构建及筛选等宏基因组技术的基础上,论述了宏基因组技术在厌氧消化研究中应用的重要性,认为该技术可成为研究微生物群落多样性的首选技术之一,有助于了解厌氧消化微生物的多样性、生态功能和动态变化,揭示厌氧消化微生物学机理,提高厌氧消化效能等.同时宏基因组技术为微生物资源的深层次开发利用提供了技术平台,并在工业、农业、海洋等领域具有广泛的应用前景.     

红树林土壤微生物模块化聚酮合酶基因(簇)及其多样性研究

聚酮类化合物(Polyketide)是一类重要的具有药用价值的生物活性分子.通过宏基因组学技术获得了红树林土壤微生物中模块化聚酮合酶(Polyketide Synthase,PKS)基因(簇),并对其多样性进行了研究.首先构建了该红树林土壤微生物的16SrDNA文库,初步分析了红树林土壤样本的细菌群落组成,发现许多菌群曾经被报道存在PKS基因簇,约占整个细菌群落的75%.利用相关菌群的PKS酮基合成酶结构域(Ketosynthase,KS)的保守区域序列信息设计简并引物,并构建了KS DNA序列文库.经测序获得131条新型KS序列,该结果表明红树林土壤微生物中蕴含了许多新型的聚酮类化合物合成酶.为了进一步获得聚酮合酶基因(簇),我们通过土壤微生物宏基因组Cosmid文库的构建与筛选,得到了13个属于trans-AT PKS,cis-AT PKS,NRPS/PKS Hybrid等类型的聚酮合酶的基因(簇),并通过构建KS序列的系统进化树分析了样本中聚酮合酶的多样性组成.     

抗稻瘟病水稻BAC文库的构建与鉴定

水稻是一种重要的粮食作物，同时也是一种重要的单子叶植物模式.稻瘟病是水稻生长中的一种严重病害，因此分离和克隆新的稻瘟病抗病基因具有重要的应用价值.以一个抗稻瘟病农家种水稻为材料，以plndigoBAC5为载体，构建了细菌人工染色体（BAC）文库.该文库共有90 000个转化子，插入频率99％，插入片段平均长度为105 kb，由此推测这个文库覆盖水稻基因组约20倍.利用其中的45 000个转化子建立了4维PCR筛选体系，并且通过4维PCR筛选体系，筛选获得了7个含水稻分蘖基因（MOC1）的阳性克隆.因此该文库是一个高质量、高覆盖率的水稻BAC文库，能有效用于目的基因的分离.     

产冷活性淀粉酶嗜冷菌的分离和纯化

文章主要对产冷活性淀粉酶的冷适应微生物进行分离和纯化。通过对菌株的分离和提取基因组DNA进行PCR扩增得到其16S rRNA基因后连接于T-载体再转入大肠杆菌JM109中，筛选阳性克隆转化子进行培养，最后提取质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测。     

红曲菌基因组文库的构建

为进一步研究红曲菌桔霉素合成相关基因,本实验选用Sau3AI酶进行部分消化红曲菌基因组DNA,再回收2-4 Kb片段进行克隆,以pUC119为载体,得到20000多个克隆子,成功构建了红曲霉基因组DNA文库。采用混合池筛方法筛选到泛素基因阳性克隆子。     

易错PCR法定向进化D-海因酶的初步研究

D-海因酶是生物转化D-型氨基酸的关键酶,在一定浓度M n2 存在下,经易错PCR法重复扩增,产物构建成pET-HDT重组子,并建立突变体文库.经筛选获得了内源DNA序列变异的变异株.进化酶催化底物海因水解的活性为亲本重组酶的1.3倍,催化底物对羟基苯海因水解的活性为亲本重组酶的2.4倍.     

蚯蚓纤溶酶7#组分基因在甲醇酵母中的克隆与表达

为了使蚯蚓纤溶酶(EFE)最佳活性组分EFE-7#基因在甲醇酵母(Pichia pastoris)中获得表达,构建了表达载体pPIC9K-EFE,通过对电击条件的优化,转化率达到5×103个/μg DNA.为了便于筛选阳性克隆,以该基因的原核表达产物为抗原免疫动物,获得了与天然EFE-7#组分具有相同免疫特异性的抗体.用该抗体为探针对上述转化子进行筛选,得到了上百株阳性重组子.RT-PCR和western blotting证明,EFE-7#基因在这些重组子中获得了表达,表达产物相对分子质量高于天然产物.     

福建红曲醋发酵液的细菌群落结构分析

采用非培养法和培养法对福建红曲醋的细菌菌落结构进行分析.从红曲醋发酵液样品中提取基因组DNA,构建16S r DNA文库.随机挑取16S r DNA文库中的克隆子进行ARDRA分析,通过部分克隆序列测定构建系统发育树.结果显示,非培养法16S r DNA克隆文库得到15种OTUs,主要分为3大菌群,分别是:Acetobacter属、Lactobacillus属、Pseudomonas属;培养法16S r DNA克隆文库得到11种OTUs,主要分为2大菌群,分别是:Acetobacter属、Lactobacillus属.在文库的标准多样性指数方面,非培养法文库的香侬-威纳指数(Shannon-Weiner index)、辛普森指数(Simpson index)、丰富度指数(Margalef's richness index)分别为2.56、0.075、3.04,培养法文库香侬-威纳指数(Shannon-Weiner index)、辛普森指数(Simpson index)、丰富度指数(Margalefs'richness index)分别为2.26、0.104、2.17.两个文库的均一度指数(Evenness index)数值均高于0.90,显示出两个文库自身较高的多样性.实验结果表明:Acetobacter属和Lactobacillus属是红曲醋发酵的优势菌群,占整个细菌群落的85%以上.红曲醋发酵是一个多菌种的发酵过程,福建红曲醋的非挥发性酸含量与其醋酸发酵伴随乳酸发酵过程产生丰富的有机酸是相关的.     

鳜鱼基因组(AC)n微卫星富集文库的构建与鉴定

鳜鱼基因组DNA经MseI酶切后,与MseI接头连接,用链霉素和素磁珠亲和捕捉与生物素标记的微卫星寡核苷酸探针(CA)8杂交,杂交复合物通过变性洗脱获得单链目的片段,经PCR扩增形成双链,然后克隆到pGEM-T 载体上,转化至大肠杆菌DH5α中,首次成功构建鳜鱼(Siniperca chuatsi)基因组(AC)n重复类型的微卫星富集文库.测序结果表明,阳性克隆率为60%,说明构建的鳜鱼基因组微卫星富集文库是一个高质量的文库.鳜鱼富集微卫星文库的建立将为下一步进行鳜鱼微卫星标记的筛选提供了有效的工具.     

活性污泥宏基因组DNA提取方法优化

宏基因组DNA的成功获取是宏基因组学技术顺利开展的关键.利用溶菌酶-SDS-蛋白酶K法（LSK法）提取活性污泥宏基因组DNA,结合单因素法与表面响应法对提取过程的4个关键步骤进行条件优化,即预处理、细胞裂解、蛋白去除及DNA沉淀过程.确定影响DNA产量的重要因素：预处理缓冲溶液与DNA沉淀剂类型、CTAB质量分数、溶菌酶浓度、37℃水浴时间及SDS质量分数.确定LSK法提取宏基因组DNA的最佳条件：TENC预处理活性污泥;1.5%CTAB;0.5mg/mL溶菌酶,37℃水浴1.4h;2%SDS,200μg/mL蛋白酶,55℃水浴2.5h;异丙醇沉淀DNA 40min.在最佳条件下,活性污泥宏基因组DNA的最大产量为每g污泥170μg.本研究可为环境样品中高质量宏基因组DNA的提取提供有价值的参考.     

高质量水稻基因组文库构建的策略和方法

采用改良的CTAB法提取水稻基因组DNA,经Sau3AI部分酶切的产物经透析袋电洗脱法回收、正丁醇浓缩后,以1∶1的摩尔数比和载体臂连接.包装后测定,文库滴度达到106pfu/ml;随机酶切重组克隆显示,插入片段达到预期的15~23 kb之间,提示该方法适于植物材料高质量基因组文库的构建,有利于分离完整的基因序列及其调控区.     

LPA法克隆嗜盐菌Halobacterium species xz515古紫质基因

Halobacterium species xz515是从中国西藏分离到的嗜盐菌，所含古紫质(古细菌视紫红质的简称命名为AR4)具有与其他已知菌视紫红质相反的质子释放和吸收的顺序而引起重视．连接反应介导的PCR扩增法(LPA)是一种克隆部分序列已知的基因的新型克隆方法．LPA法利用“酶切-连接-PCR”之组合，首先选定一组限制性内切酶，各自单独地酶切细菌总DNA样品，然后酶切产物分别与相应的寡聚核苷酸片段接头连接．连接液混合起来，作为扩增未知序列DNA的模板．通过这种方法，克隆到了包括完整AR4基因开放阅读框和0．4kb上游调控区域的总长度1．3kb的DNA片段．实验结果表明LPA法可以代替传统的构建基因组DNA文库的方法，可以快速有效地获得目标基因相关的序列．     

黑曲霉F246的phyA基因克隆及其新型表达载体构建

利用PCR法直接从自行筛选、鉴定的黑曲霉F246中扩增出phyA基因,再将PCR产物重组于乳酸菌表达载体pMG36e,构建phyA基因的新型表达载体pMG36e-phyA.以黑曲霉F246基因组为模板,对phyA基因的成熟肽(1 347 bp)进行PCR扩增.再将PCR产物克隆入pMD18T质粒,经DNA测序和氨基酸分析、鉴定正确后,亚克隆入乳酸菌表达质粒pMG36e,构建工程菌Lactobacillus MG1363-pMG36e-phyA.重组乳酸菌表达载体pMG36e-phyA的构建,可望获得大量、高活性植酸酶,为研制多功能微生态制剂奠定基础.     

大鼠APKD基因的分子克隆研究：Ⅰ.大鼠基因组文库的构建

以质粒ＰＢＲ３２２为载体、ＢａｍＨＩ部分酶切片段（４～１０ｋｂ）为目的片段成功构建了大鼠基因组文库并进行了鉴定，文库总重组子数为３．２×１０７，插入比例９５％，为大鼠ＡＰＫＤ基因的克隆筛选以及有关大鼠基因的其它一些研究奠定了基础．     

温泉环境宏基因组文库中醛脱氢酶基因的克隆及分析

甲基丙二酸半醛脱氢酶(MMSDH)是唯一需要CoA的一类醛脱氢酶.采用免培养-PCR技术结合基因组步移从宏基因组中成功分离一条MMSDH,获得的MMSDH在序列上具有醛脱氢酶的10个保守模块,以芽胞杆菌的MMSDH为模板预测其三维结构.研究证实采用免培养-PCR技术及基因组步移在微生物基因研究中具有重要的价值,且为新酶的筛选技术提供一条简单有效的途径.     

利迪链霉菌A02细菌人工染色体基因组文库的构建

 利迪链霉菌A02是从京郊森林土壤中分离筛选出的植物真菌病害高效生防菌,其活性产物为安全高效广谱的抗真菌剂纳他霉素。为了克隆纳他霉素生物合成基因簇和调控其表达相关的功能基因,通过基因改良的方式进行A02的定向分子改造,提高纳他霉素的效价和产量,提取了利迪链霉菌A02的基因组DNA,用Hind III和Bam HI部分酶解后,回收了97~194kb和48.5~97kb大小的高分子量DNA,与质粒载体Copycontrol pCC1BAC连接,分别构建了含有800个和1500个克隆的两个BAC文库。从文库中随机挑选20个克隆,酶切检测平均插入片段分别为133kb和65kb,空载率小于1%,假定利迪链霉菌的基因组有8×10⁶kb,计算文库基因组覆盖率分别为12.28倍和11.25倍。因此,从文库筛选到目的片段的概率达99.99%以上。