棉花黄萎病菌 T-DNA 插入突变体功能基因及生物学性状分析

【目的】分析棉花黄萎病致病菌相关基因的功能揭示其中致病机制。【方法】通过 ATMT 法构建了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae ) 650 个 T-DNA 插入突变体。利用 hiTAIL-PCR 技术获得 17 株 T-DNA 插入体侧翼基因序列,通过blast 比对分析表明,其中 16 个基因序列编码酶或蛋白。【结果】突变体的生物学性状与野生型菌株 Vd991 相比,出现黄色菌丝型 2 株,中间菌丝型 6 株;部分突变体在生长速率( 7 株)、产孢量( 14 株)和粗毒素产量( 4 株)上都发生了具有统计学意义的变化(p <0.05 );致病力测定表明, 9 株突变体的致病力较野生型有所降低,在 p <0.05 水平具有统计学意义。
     

绿色木霉菌LTR-2产生的真菌柴油——烃类物质及其衍生物

采用PDA培养基和麸皮培养基培养绿色木霉（Trichoderma viride）菌株LTR-2,以二氯甲烷浸提法提取培养物中的代谢产物,利用气相色谱-质谱联用仪分析提取物中的化学成分,应用峰面积归一化法确定各成分的相对含量。从PDA培养物中共检测到39种化学成分：其中链烃类物质有17种,相对含量为20．62％;脂环烃有1种,相对含量为0．80％;芳香烃有5种,相对含量为19．94％;烃类衍生物有13种,包括醛、酮、醇、酯等,相对含量为56．07％;其它成分有3种,相对含量为2．29％。从麸皮培养物中共检测到57种化学成分,其中链烃类物质有32种,相对含量为39．06％;脂环烃有3种,相对含量为1．29％;芳香烃有2种,相对含量为1．56％;烃类衍生物有15种,包括酮、酸、醇、烯、酯等,相对含量为55．40％;其它成分有5种,相对含量为2．37％。绿色木霉菌LTR-2在不同培养基上产生的烃类物质及其衍生物的种类、数量和相对含量均不相同,这些代谢产物大多与化石柴油的主要成分相同。该结果表明,利用绿色木霉生产真菌柴油具有潜在的研究和应用价值。     

棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体功能基因及生物学性状分析

【目的】分析棉花黄萎病致病菌相关基因的功能揭示其中致病机制。【方法】通过ATMT法构建了大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)650个T-DNA插入突变体。利用hiTAIL-PCR技术获得17株T-DNA插入体侧翼基因序列,通过blast比对分析表明,其中16个基因序列编码酶或蛋白。【结果】突变体的生物学性状与野生型菌株Vd991相比,出现黄色菌丝型2株,中间菌丝型6株;部分突变体在生长速率(7株)、产孢量(14株)和粗毒素产量(4株)上都发生了具有统计学意义的变化(p0.05);致病力测定表明,9株突变体的致病力较野生型有所降低,在p0.05水平具有统计学意义。【结论】该研究为大丽轮枝菌致病基因的筛选和鉴定提供了理论基础。     

一株拟南芥晚花突变体的分子分析

植物的开花时间直接控制植物营养生长期和生育期的长短,在相当程度上决定着繁育的成功与否,也与植物的产量和质量性状密切相关.拟南芥花期改变突变体是植物开花调控机制研究重要的植物材料.研究利用前期研究中获得的一株稳定遗传的、晚花表型的T-DNA插入拟南芥突变体pex2为材料,对其进行开花相关表型分析、T-DNA插入位点鉴定及插入位点基因转录分析等研究,结果表明:pex2突变体中存在单一的T-DNA插入,该插入位点位于PEX2基因下游约1 800 bp处,且该位点的插入引起了PEX2全长转录产物的缺失.该研究为进一步探索pex2突变体晚花机制及拟南芥PEX2基因与晚花表型之间的相关性研究,提供了研究材料.     

木霉及其制剂对棉花真菌病害的防治效果

在盆栽条件下,9个木霉菌株对棉花丝核菌立枯病的防治效果为39．71％-82．35％,14个菌株对棉花枯萎病的防治效果为37．5％-75．00％,9个菌株对棉花黄萎病的防治效果为30．49％-65．85％。制备了绿色木霉LTR-2的可湿性粉剂,田问条件下处理种子及灌根,菌剂对棉花枯萎病的防治效果达50．1％-80．0％。     

木霉拌种剂对小麦根际土壤真菌群落多样性的影响

采用Illumina Miseq高通量测序平台,对木霉LTR-2拌种剂拌种小麦后不同发育时期小麦根际土壤真菌进行测序,分析群落丰富度、多样性以及结构。结果表明,木霉拌种处理小麦可以增加小麦根际真菌群落的丰富度,对真菌群落的均匀度影响不明显,但真菌群落的优势度有明显的增加;木霉拌种处理后小麦根际土壤真菌的菌群结构构成相近,没有发生明显变化,但各真菌类群所占比例发生了明显的变化,其中一些病原真菌如链格孢属、赤霉属、镰刀菌属所占比例较不拌种处理均有所降低。该研究为木霉菌LTR-2防治小麦土传病害的生防机制提供了理论依据。     

拟南芥AtHHR2基因的功能初步研究

为了研究拟南芥Highly Homologous RING domain 2基因(At5g43200)在盐胁迫逆境的功能,通过DNA及RNA水平鉴定了该基因的T-DNA插入突变体athhr2,并通过根瘤农杆菌介导法进行遗传转化,筛选获得了athhr2/ATHHR2互补转基因株系.对突变体、互补转基因株系及野生型进行盐胁迫处理,对其萌发率、脯氨酸及叶绿素水平进行检测,发现盐处理后缺失突变体的萌发率降低,脯氨酸和叶绿素含量低于野生型,互补株系的萌发率、脯氨酸和叶绿素含量均高于野生型.以上结果证明AtHHR2基因在拟南芥的盐胁迫响应中起正调控作用.     

哈茨木霉LTR-2对蔬菜种子和幼苗耐盐性的影响及其作用机制

研究了盐胁迫条件下哈茨木霉LTR 2处理对黄瓜、萝卜和番茄3种蔬菜的种子萌发、幼苗生长和生理生化反应的影响。结果表明,盐胁迫条件下,LTR-2处理的蔬菜种子萌发率明显高于未处理;LTR-2处理的蔬菜幼苗的株高、鲜重、叶片中叶绿素含量、净光合作用速率（Pn值）以及抗氧化酶活性明显高于未处理,而膜质损伤（相对电导率和丙二醛含量）弱于未处理的幼苗。哈茨木霉LTR-2能够促进盐胁迫下蔬菜种子的萌发以及幼苗的生长和光合作用,提高幼苗的抗氧化能力并降低膜质损伤,增强幼苗对盐胁迫的耐受性。     

拟南芥突变体lac8-2和lac8-3的鉴定

本课题组已通过基因工程方法证实,拟南芥At5g01040的编码蛋白Lac8具有漆酶活性.本研究通过PCR扩增技术,成功筛选出Lac8基因的T-DNA插入突变体lac8-2和lac8-3的纯合子.RT-PCR分析表明,突变体中没有Lac8基因的表达.因此,lac8-2和lac8-3均可作为Lac8基因的功能缺失突变体,这为进一步研究Lac8基因在拟南芥生长发育中的功能奠定了材料基础.     

哈茨木霉LTR-2对冬小麦籽粒的影响

为了探明生防木霉菌剂LTR-2对冬小麦籽粒的影响,同时提供一种提高小麦品质的实践方法,以济麦44为试验材料,在孕穗期喷施不同浓度木霉菌剂LTR-2,对小麦籽粒千粒重、蛋白质、氨基酸和湿面筋含量进行测定与分析。结果表明,在小麦孕穗期喷施不同浓度的木霉菌剂,小麦籽粒千粒重、蛋白质、氨基酸和湿面筋含量均较对照有提高,孕穗期喷施木霉菌剂有助于提高产量以及小麦籽粒营养品质和加工品质。     

哈茨木霉LTR-2对椒样薄荷耐盐生理特性的影响

木霉菌(Trichoderma spp.)是一类能够刺激作物生长并增强其抵抗生物和非生物胁迫能力的多功能益生真菌,目前国内外对于生防木霉菌在增强植物耐盐性及其作用机理方面尚缺乏深入、系统的研究。本文研究了生防木霉菌LTR-2对椒样薄荷耐盐生理特性的影响,结果显示,在200 mmol/L NaCl胁迫下,LTR-2有效缓解了盐胁迫对椒样薄荷的生长和光合的抑制。探讨了LTR-2接种的椒样薄荷耐受NaCl胁迫的生理生化基础,结果表明,LTR-2提高了椒样薄荷的抗氧化活力,减少了活性氧积累;增强了细胞膜和液泡膜H+-ATPase以及Na+/H+逆向转运蛋白等离子转运通道的活性,从而调节盐分的吸收和分布。这些结果为椒样薄荷在盐碱地区的引种及木霉菌剂的开发应用提供了实验依据。     

木霉菌LTR-2可湿性粉剂对6种蔬菜灰霉病的田间防治效果

在田间用木霉菌LTR-2可湿性粉剂1 500 g/hm2喷雾,防治番茄、茄子、五彩椒、辣椒、扁豆和黄瓜6种蔬菜叶部灰霉病的效果分别为77.96%、64.45%、71.43%、70.24%、72.71%、75.41%,对照药剂40%嘧霉胺悬浮剂480 g/hm2的防治效果为71%~81%。木霉菌可湿性粉剂的施药时期应掌握在发病初期,以后每隔7 d用1次药,连续用药2~3次。使用剂量1 500 g/hm2,可有效地防治蔬菜灰霉病的发生。     

土壤调理剂和木霉LTR-2联合施用对小油菜连作障碍土壤的修复

为探寻叶菜在连作障碍土壤中的安全生产措施,采用设施大棚小区试验,以土壤pH、土壤电导率、病害防效及增产率为评价指标,研究了土壤调理剂和木霉LTR-2联合施用对小油菜连作障碍土壤的修复作用,并根据土壤养分含量测定结果,进行了减肥试验。结果显示:经7 500 kg /hm²土壤调理剂处理后,土壤pH由4.50升至6.95;土壤电导率由675.10 μS/cm降至519.70 μS/cm。施肥后与施肥前相比,B(土壤调理剂+有机肥I+复合肥)和C(土壤调理剂+有机肥I+LTR-2+复合肥)处理组中土壤pH均下降,土壤电导率均升高。经一茬种植后,与施肥后相比,收获时的pH分别从6.43和6.57降至6.06和6.26,土壤电导率由1 011.43 和959.47 μS/cm降至955.70 和863.43 μS/cm;与常规处理A(有机肥II+复合肥)组相比,小油菜种植前后,B和C处理组中土壤pH和土壤电导率都存在显著差异;B和C处理组中根腐病防效分别为65.39%和80.77%;增产率分别为27.48%和33.59%。A、B、C三个处理速效养分在土壤中均有不同程度的过剩累积。与常规处理A'(有机肥III+复合肥)组相比,D'(有机肥I+LTR-2+1/3复合肥)处理组在减施复合肥66.67%的情况下,增产率为9.31%。     

木霉对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的作用机理

木霉对棉花枯萎病菌(Fumrium oxysporum f.sp.Vasinfectum)的幼菌丝具有强烈的寄生能力,对于老熟菌丝的寄生能力较弱。木霉能够产生琼脂扩散性和挥发性抑菌物质。绿色木霉LTR-2产生的挥发性抑菌物质能强烈抑制棉花枯萎病菌的菌丝生长。木霉生物防治作用的另外一种方式是与病原菌竞争营养物质,研究发现葡萄糖是竞争对象之一。木霉具有很强的β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性。培养液中添加几丁质、木霉菌或者棉花枯萎病菌菌丝干粉后培养木霉,培养液上清能够破坏枯萎病菌的菌丝尖端并导致原生质体的泄露,该现象主要与木霉的几丁质酶活性有关。木霉对棉花黄萎病菌具有相同的作用方式。     

利用根癌农杆菌介导的转化方法改良木霉菌

根癌农杆菌介导的转化系统在丝状真菌的研究中具有重要的意义。通过农杆菌介导,成功实现了丝状真菌绿色木霉菌(Trichoderma viride)遗传转化,转化率约为30～80个转化子／10^5个孢子。PCR检测和几丁质酶分析表明含有编码几丁质酶外源基因(Cli 113)的T-DNA已整合进木霉菌基因组中,而且转化子都能够稳定遗传。农杆菌介导的遗传转化方法具有转化率高、操作简便、遗传稳定等优点,在丝状真菌的遗传转化中具有重要的意义。     

Hlrg基因定点突变体的构建及其对HepG2细胞的影响

构建Hlrg基因的定点突变体,研究突变Hlrg基因表达的蛋白对HepG2细胞的影响.首先利用数据库对Hlrg基因的结构特点进行分析,在此基础上用PCR法构建Hlrg基因的定点突变体.将突变的Hlrg基因克隆到pcDNA3.1（＋）载体中,并稳定转染到HepG2细胞中.流式细胞仪和透射电镜观察突变基因表达的蛋白对HepG2细胞的影响.结果获得了针对Hlrg基因的定点突变体,亮氨酸拉链中的第二个亮氨酸被突变成丝氨酸.发现稳定表达HLrgm蛋白的HepG2细胞中出现一定比例的凋亡细胞.表明构建了Hlrg基因定点突变体,为进一步的功能研究奠定了基础.