离子交换色谱流动相组成对核糖核酸酶的折叠影响

用离子交换色谱法（IEC）研究了还原变性核糖核酸酶（RNase A）折叠过程中，复性缓冲液种类及pH值、流动相中脲浓度及盐种类对还原变性核糖核酸酶复性的影响。发现pH为弱碱性，用PBS作为缓冲液能提高复性效率；当流动相中含有2．0mol／L脲时复性产率较高；洗脱剂用NaCl时活性回收率较高。     

添加剂促进变性还原溶菌酶复性的作用

研究了多种添加剂促进变性还原溶菌酶复性的作用，考察了添加剂浓度及变性剂盐酸胍浓度对复性收率的影响．结果表明，精氨酸、乙酰胺、丙酮、硫脲及甘油均能有效促进变性溶菌酶复性，并且存在最佳的添加剂浓度使变性溶菌酶的复性收率最大．在促进复性中，乙酰胺等结构类似物与盐酸胍具有相同作用，因此，在降低复性液中盐酸胍浓度的同时，适当提高乙酰胺浓度即可获得较高的复性收率．当盐酸胍浓度为0．2mol／L时，复性收率达到90％时的乙酰胺浓度为2mol／L，但降低盐酸胍浓度至0．06mol／L时，达到相同变性收率的乙酰胺浓度需要4mol／L．甘油与盐酸胍存在着协同作用，在一定浓度的盐酸胍存在下，添加适量的甘油能获得较高的复性收率．     

L-精氨酸对提高蛋白质复性与纯化率的作用及其分析

分别以还原变性的溶菌酶(Lys)和大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的重组人酪氨酸激酶配体(Recombined human Flt3ligand,rhFL)为不同来源的变性蛋白,利用荧光光谱技术分析L-精氨酸(L-arginine,L-Arg)作为小分子添加剂时,蛋白质折叠液相色谱(PFLC)法对变性蛋白质的复性效果,以及变性蛋白复性过程中的复性效率、荧光强度与蛋白构象变化的规律与关系,为解决包涵体蛋白质难于复性和复性效率低的问题提供可靠的数据.     

脲对含内蛋白子前体蛋白剪切的影响

研究了含内蛋白子的前体蛋白［麦芽糖结合蛋白－内蛋白子－几丁质酶结合区（ＭＹＢ）］在脲溶液中的分子构象及变性和复性过程中剪切活性与光谱变化的关系。结果表明，剪切活性随脲浓度的增加而逐渐丧失；当脲浓度大于６ｍｏｌ／Ｌ时，活性完全丧失。变性过程中Ａ２８０ｎｍ随变性程度增加而增强，复性后Ａ２８０ｎｍ与天然态Ａ２８０ｎｍ值相近，剪切活性随之恢复。说明构象松散先于剪切活性，可能在重折叠时，构象核化对剪切活性致关重要。     

还原变性的溶菌酶的体积排阻色谱复性

探讨二次体积排阻色谱在非氧化还原平衡体系及中性条件下对还原变性的溶菌酶(Lys)的复性.结果表明:在初次排阻色谱的溶菌酶洗脱液中加入过量的氧化型谷胱苷肽(GSSG)和盐酸胍(GuHCI)充分作用后,进行二次体积排阻色谱能够成功复性还原变性的溶菌酶.     

XynⅢ包涵体的纯化与变复性研究

常规诱导表达后收集的粗包涵体经3mol／L尿素洗涤加上表面活性剂Triton X-100作用，可将包涵体中xynⅢ的含量从37％提高到92．4％；8mol／L尿素可将包涵体完全溶解；蛋白浓度在0．2～0．25mg／mL时，pH4．550mmol／L NaOAc与pH7．520mmol／L Tris—HCl缓冲液复性效果相当；降低蛋白浓度，则是pH7．520mmol／L Tirs-HCl缓冲液复性效果相对较好；复性过程中加入DTT、EDTA、尿素、木糖等处理复性效果没有明显提高；pH7．520mmol／L Tris—HCl、0．01mg／mL蛋白浓度条件下，包涵体的复性效果最佳．     

白鲫鱼C-反应蛋白提取条件的优化

探讨了白鲫（Carassius auratus cuvieri）C反应蛋白（CRP）亲和层析法提取过程中,不同的硫酸铵饱和浓度、缓冲液pH值、缓冲液离子强度和配基浓度下对白鲫CRP的提取效率的影响.结果发现,在硫酸铵饱和浓度80%,缓冲液pH值8.5,缓冲液离子强度为0.05 mol/LTris以及配基浓度为8μmol/mL介质的条件下,白鲫CRP的提取效率最高.     

白鲫鱼C-反应蛋白提取条件的优化

探讨了白鲫(Carassius auratus cuvieri)C反应蛋白(CRP)亲和层析法提取过程中,不同的硫酸铵饱和浓度、缓冲液pH值、缓冲液离子强度和配基浓度下对白鲫CRP的提取效率的影响.结果发现,在硫酸铵饱和浓度80%,缓冲液pH值8.5,缓冲液离子强度为0.05 mol/LTris以及配基浓度为8 μmol/mL介质的条件下,白鲫CRP的提取效率最高.     

利用温敏性凝胶的缓释作用促进变性溶菌酶复性

为了开发温敏凝胶在蛋白质复性方面的方法，利用N-异丙基丙烯酰胺温敏凝胶具有的缓释作用，对变性蛋白质进行了复性．考察不同合成条件下凝胶的性能，结果表明，在制胶温度为22℃、凝胶单体浓度为10％、交联度为5％制得的凝胶，具有较好的机械强度、较大的溶胀倍率、缩水倍率及良好的温敏性能．凝胶的缓释作用对变性还原溶茵酶辅助复性的影响表明，在复性酶终浓度为0．5mg／mL时，凝胶辅助蛋白质的复性收率可达68％，比直接稀释复性（收率为57％）高19％．特别是对高浓度蛋白质的复性（1．5mg／mL），凝胶辅助复性也获得了很好的效果，复性收率高出直接稀释复性37％，表现出温敏凝胶在实际蛋白质复性中的应用前景．     

人工伴侣辅助溶菌酶复性的影响因素

为了获得人工伴侣辅助蛋白质复性方法的广泛应用,本文以二硫苏糖醇还原、盐酸胍变性的溶菌酶为目标蛋白质,优化复性过程中的一些条件.首先确定了溶菌酶浓度为0.06 mg/mL时,复性的最佳氧化还原体系GSSG/GSH均为3 mmol/L;然后证明了要达到较高的复性收率,在水浴环境下,需要较长的时间和较大的β-CD浓度(24 h,CTAB/β-CD为1.2 mmol/L:14.4 mmol/L),收率可达90%以上.而在摇床环境下,利用较短时间和较低的β-CD浓度(1 h,CTAB/β-CD为1.2 mmol/L:4.8 mmol/L)就可以达到一定的复性收率(70%以上);进一步实验证明,若想在1 h内达到理想的复性效果,可以选用1.2 mmol/L:4.8 mmol/L的CTAB/β-CD,摇动10 min,然后保持静止,可达到70%以上的收率.     

Lysozyme refolding at high concentration by dilution and size—exclusion chromatography

This study of renaturation by dilution and size exclusion chromatography (SEC) addition of urea to improve yield as well as the initial and final protein concentrations showed that although urea decreased the rate of lysozyme refolding, it could suppress protein aggregation to sustain the pathway of correct refolding at high protein concentration; and that there existed an optimum urea concentration in renaturation buffer. Under the above conditions, lysozyme was successfully refolded from initial concentration of up to 40 mg/mL by dilution and 100 mg/mL by SEC, with the yield of the former being more than 40% and that of the latter being 34.8%. Especially, under the condition of 30 min interval time, i.e. tau > 2(t(R2) - t(R1)), the efficiency was increased by 25% and the renaturation buffer could be recycled for SEC refolding in continuous operation of downstream process.     

多功能蛋白增活器的研制及性能研究

自制了一种新型的多功能蛋白增活器,它具有同时除变性剂、分离杂蛋白、复性目标蛋白及便于回收变性剂的功能。考查了其对蛋白的分离、复性性能。发现这种多功能蛋白增活器可对６种标准蛋白进行良好地分离。同时对盐酸胍变性的溶菌酶和核糖核酸酶完全复性。通过测定压力－流速曲线,发现多功能蛋白增活器的压力均远远低于普通色谱柱。将其应用于基因工程发酵的粒细胞集落因子（Ｇ－ＣＳＦ）的分离纯化,可使纯度接近于１００％,生物活性大于常规方法３倍     

巴斯德毕赤酵母发酵生产重组人溶菌酶

对巴斯德毕赤酵母GS115菌株在工业培养基中发酵和分离条件进行了研究。结果表明：将传统工业培养基中碳源和氮源的质量浓度分别降低至35 g/L和5 g/L时,酵母生长期的细胞密度与传统培养基的相差不大,但培养时间可减少4 h,节省了生产成本;维持诱导期间的pH值为4.0对目标蛋白的表达最有利,目标蛋白的表达量占酵母分泌蛋白总量的70％,比原来增加了近30％;分离纯化过程,采用将强阳离子（SPFF）与弱阴离子（DEAE）交换层析柱偶联的分离方法,达到除杂,并浓缩目标蛋白的作用,目标蛋白产量约为50 mg/L;将目标蛋白酶切后,质量酶活性为8.56×10-3 mol/(s•g)。     

AiiA融合蛋白包涵体变性和复性的研究

通过IPTG诱导含有pGEXaiiA-B15质粒的工程菌使其大量表达AiiA融合蛋白.由于所表达的融合蛋白多为不可溶的包涵体,须经分离、变性溶解,再经过一个合适的复性过程才能实现变性蛋白的正确折叠,得到具有生物活性的蛋白.通过含N-十二烷基肌氨酸钠的缓冲液A溶液及尿素等变性剂使包涵体溶解,磷酸盐缓冲液透析复性.SDS-PAGE电泳表明包涵体已由不可溶转化成可溶的蛋白.抑菌试验证明复性后的AiiA蛋白对胡萝卜欧文氏软腐病菌引起的马铃薯软腐病有较明显的抑制作用.     

溶菌酶标准酶活曲线测定方法的改进

天然溶菌酶活性（标准酶活）的测定是蛋白质复性研究过程中的一个关键步骤。为了增加测定数据的准确性和可比性,改进了测定标准酶活的方法。在固定其他条件的前提下,对于影响标准酶活的重要因素-温度,采用空调控制室温的方法,使其规律性由低到高变化。同时将测活液放置在与所控制室温相同的水浴环境中保持温度,测出各种温度下曲线的斜率,用直线进行拟合。对于其他没有测定的温度点,可以从拟合曲线中求出。这样,通过一组实验便可以得到任意温度下的标准酶活。     

溶菌酶标准酶活曲线测定方法的改进

天然溶菌酶活性(标准酶活)的测定是蛋白质复性研究过程中的一个关键步骤.为了增加测定数据的准确性和可比性,改进了测定标准酶活的方法.在固定其他条件的前提下,对于影响标准酶活的重要因素-温度,采用空调控制室温的方法,使其规律性由低到高变化.同时将测活液放置在与所控制室温相同的水浴环境中保持温度,测出各种温度下曲线的斜率,用直线进行拟合.对于其他没有测定的温度点,可以从拟合曲线中求出.这样,通过一组实验便可以得到任意温度下的标准酶活.     

紫苏油中α-亚麻酸的分离纯化

研究了紫苏油中α–亚麻酸的分离纯化技术.采用尿素包合与硝酸银溶液络合萃取相结合的方法,考察了尿素包合过程中混合脂肪酸、尿素、乙醇的比例以及硝酸银萃取过程中硝酸银浓度对α–亚麻酸纯化的影响.结果表明,在脂肪酸、尿素和95%乙醇质量比为1﹕1.5﹕4.8,包合温度为–18,℃,包合时间为12,h,硝酸银浓度为4,mol/L,0,℃条件下络合,α–亚麻酸纯度达99.08%,回收率为39.24%,尿素和硝酸银的回收率分别为60%和90%以上.     

基因重组人骨形成蛋白4成熟肽在大肠杆菌中的大规模发酵表达及纯化

含有编码人骨形成蛋白4成熟肽(Bone morphogenetic protein 4 mature peptide,hBMP-4m)cDNA表达质粒的菌株,经50代传代,质粒不丢失,仍然稳定高表达hBMP-4m。将此菌株导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵、诱导表达,测定发酵菌液OD600值为43.5,离心收集菌体,PAGE电泳结果hBMP-4m占细菌总蛋白量的39％。悬浮所收集的菌体、裂菌,洗涤后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的85％。将少量包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解分别上SP阳离子和Q阴离子交换柱,用连续盐浓度的洗脱液洗脱蛋白,收集各蛋白峰做蛋白电泳分析,找到洗脱液的最合适盐浓度。然后将全部包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解,上阳离子交换柱SP柱,以最佳盐浓度洗脱液洗脱,获得纯度为91％的hBMP-4m。再上阴离子交换柱Q柱,最佳盐浓度洗脱液洗脱后,所得hBMP-4m纯度为98％。     

KVO3-NaVO3-CO(NH2)2-H2O体系298 K相关系实验研究

钒在土壤溶液中的溶解性能要受共存离子种类及含量的影响.作者采用等温溶解平衡法研究了KVO3-NaVO3-CO(NH2)2-H2O四元体系298 K时的溶解度相关系,考察了钾、钠、脲素等共存离子或盐类同偏钒酸根离子的相互作用.该四元体系298 K时的溶解度等温图含有3个相区、3条单变量线和1个无变量点.无变量点的平衡固相盐为KVO3 NaVO3 CO(NH2)2;体系中没有复盐或固溶体形成,3个结晶相区分别为盐KVO3,NaVO3和CO(NH2)2的结晶区,其中KVO3的结晶区最大,表明钾离子的存在不利于土壤中钒的溶解.体系共存盐间存在盐析作用.