内蒙古额吉淖尔盐碱湖一株产视紫红质的极端嗜盐古菌的分离及其bop基因核心序列及最适生长条件的分析

从内蒙古额吉淖尔湖分离得到一株产视紫红质的极端嗜盐古菌,初步鉴定为属于Natrinema属;并扩增出了其bop基因,该bop基因序列已在Genbank中注册,编号为KF863690,分析了其核心序列。结果表明bop基因开放阅读框为303 bp,编码101个氨基酸。blastp结果表明该蛋白属于Bac-rhodopsin蛋白家族,具有典型的细菌视紫红质蛋白结构域。利用BLAST进行相似性分析发现bop编码蛋白氨基酸序列与Genbank中编号AAS87571.1、WP-007110705和AFB77278.1的视紫红质蛋白相似性达到98%以上。此结果表明视紫红质蛋白在细菌及古菌中结构上具有很高的保守性,与其质子泵功能紧密相关。最后分析了该菌株的最适生长条件。该菌株在分离培养基中适宜生长的NaCl浓度范围为1.0~3.0 mol/L,适宜生长pH为6.5~8.5,适宜生长镁离子浓度为0.4~0.8 mol/L。通过分析比较得出该嗜盐古生菌株生长最适NaCl盐浓度为1.5 mol/L,最适pH值为7.5,最适镁离子浓度为0.4 mol/L。该实验结果为今后进一步研究产视紫红质的极端嗜盐古生菌株的生理生化特征及遗传学特征奠定了基础。     

嗜盐古菌ABDH12的部分生理生化特征及Br蛋白基因部分序列的研究

文章分析新疆艾比胡嗜盐古生菌物种与细菌视紫红质（bacteriorhodopsin，BR）蛋白基因资源，对分离纯化到的极端嗜盐古生菌菌株ABDH12，对其进行了生理生化特性研究，采用PCR方法扩增技术和编码螺旋c至螺旋G的BR蛋白基因片断，测定了BR蛋白基因核心序列。基于生理生化特性和BR蛋白基因序列的同源性比较，以及系统发育分析表明，BR蛋白中对于完成质子泵功能以及与视黄醛结合的关键性氨基酸残基均为保守序列，位于膜内侧的序列比位于膜外侧的序列更保守，并且ABDH12中的螺旋C至螺旋G的蛋白与其他菌株差异明显，是两种新的BR蛋白，序列号为：FJ796897。迄今为止，国内极少有关艾比湖嗜盐古菌的BR蛋白研究的报道，文章可为今后研究同类极端环境中新的物种资源提供素材和参考。     

链球菌Fc结合蛋白G基因的克隆与原核表达

为研制SPG相关免疫试剂盒,设计了1对引物,从C群链球菌C40株基因组中扩增出了387 bp的细胞壁结合蛋白G(streptococcal protein G,SPG)基因,该基因编码125个氨基酸,包含了C1和C2两个Ig G结合结构域.构建了原核表达载体p ET28a(+)-SPG,IPTG诱导表达出分子质量约15.0 ku的SPG蛋白,并应用亲和层析柱纯化了SPG蛋白,Western blot分析表明纯化SPG蛋白具有生物学活性.     

山羊Wnt10b的原核表达和多克隆抗体制备

利用RT-PCR扩增法获取山羊Wnt10b基因序列并将该目的片段连接到原核表达载体p ET32a,转化E.coli表达菌BL21(DE3),构建了Wnt10b/p ET32a(+)-BL21(DE3)工程菌,以IPTG诱导表达Wnt10b融合蛋白,Ni柱亲和层析纯化蛋白,将获得抗原免疫新西兰大白兔,获得了1:243000效价的山羊Wnt10b基因的多克隆抗体,为后续山羊Wnt10b基因功能研究提供参考.     

酿酒酵母金属硫蛋白的表达、纯化及活性检测

通过PCR从酿酒酵母基因组DNA上扩增得到酿酒酵母基因CUP1编码的金属硫蛋白序列.将其编码序列克隆到质粒pTWIN1构建重组表达质粒pTWIN1-MT,转化大肠杆菌感受态细胞ER2566.重组融合蛋白CBD-intein1-MT在IPTG的诱导下得到表达,经SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定.用重组菌分别进行铜离子耐受...     

苏云金芽孢杆菌BtR05普鲁兰酶基因pul在重组大肠杆菌中的自诱导表达

以苏云金芽孢杆菌BtR05基因组DNA为模板,PCR扩增得到其普鲁兰酶基因pul,构建了表达载体p ET(K)-Trx-pul,转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中。用IPTG和自诱导表达系统分别对该酶基因进行诱导表达。Tricine-SDSPAGE结果表明,普鲁兰酶基因pul可通过自诱导获得大量表达。     

猪链球菌乳酸脱氢酶基因的原核表达及重组蛋白的反应原性研究

为了验证双向电泳筛选出的7型猪链球菌WH分离株免疫相关蛋白乳酸脱氢酶的反应原性,本实验采用克隆表达的方法对其进行研究。根据质谱鉴定的NCBI登录号查找乳酸脱氢酶基因序列,并设计特异性引物,对乳酸脱氢酶基因进行扩增,克隆入p ET30a载体,构建重组质粒p ET30a-LDH,测序后转化入大肠埃希氏菌中。用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。SDS-PAGE分析结果显示表达的重组融合蛋白相对分子量为41ku;Western blot分析结果显示该重组蛋白可与7型猪链球菌WH分离株多克隆抗体发生特异性血清学反应。这表明表达的重组LDH蛋白具有良好的反应原性,为预防和控制猪链球菌病提供有效的疫苗候选分子奠定基础。     

A组乙型溶血性链球菌DNaseB基因亚克隆及pET-28a(+)-DNaseB载体构建

运用PCR扩增技术,以质粒pMD18-T-DNaseB为模板,扩增出0.5 kb截短的DNaseB基因,先将该基因片段与pMD19-T载体连接,确定该序列正确并进行大量繁殖后,再将DNaseB基因定向克隆入pET-28a( )表达载体中,构建新的原核表达载体pET-28a( )-DNaseB,转化该重组质粒至受体菌E.coliDH5a中,采用SDS碱裂解法提取该质粒DNA,经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定和核苷酸序列分析,证实插入的基因片段具有正确的DNaseB基因核苷酸序列,将pET-28a( )-DNaseB转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经过IPTG诱导其目的蛋白得到了表达.     

单核细胞增生性李斯特菌srtA基因的克隆与原核表达

为了探究从新疆发病绵羊中临床分离的单核细胞增多性李斯特菌(简称LM90SB2)srt A基因的特异性及其在原核表达质粒p ET32a中的表达,本研究利用PCR技术扩增LM90SB2的srt A基因,测序后并进行序列比对分析,将其克隆到原核表达质粒p ET32a中构成重组表达质粒p ET32a-srt A。重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导使其表达,SDS-PAGE电泳检测,同时采用Western-blotting对表达产物进行了鉴定。结果表明:Srt A蛋白在BL21(DE3)中大量表达,表达产物经SDS-PAGE电泳和Western-blotting检测分析其为1个分子量为47 ku的融合蛋白,与预期的大小相符合,成功的构建了重组质粒p ET32a-srt A,并使其在BL21(DE3)中获得了高效的表达。本研究为下一步研究其对李斯特菌致病性的影响及制备单克隆抗体奠定了基础。     

微泡菌ALW1褐藻胶裂解酶AlgL14的表达及信息学分析

以微泡菌(Microbulbifer sp.) ALW1的基因组为模板,使用褐藻胶裂解酶AlgL14特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆至p MD18-T载体后进行测序,并对该基因编码的蛋白质序列进行生物信息学分析。将目的基因插入pET-28α(+)表达载体,转入Escherichia. coli BL21 (DE3)中进行诱导表达,并利用亲和层析进行重组蛋白纯化。结果显示,克隆基因的大小为1 350 bp,预测编码含有449个氨基酸残基的蛋白质。该蛋白质序列与其他菌株来源的褐藻胶裂解酶序列具有一定的相似性,预测克隆的目的基因编码褐藻胶裂解酶,归属于PL-14家族。褐藻胶裂解酶AlgL14的理论分子质量大小为48. 772 ku,理论等电点为6. 27。采用同源建模法建立菌株ALW1褐藻胶裂解酶AlgL14的三维结构,富含β-折叠。将目的基因在E. coli BL21 (DE3)中进行诱导表达,并纯化获得重组褐藻胶裂解酶。SDS-PAGE分析显示,表达的目的蛋白分子质量约为48. 8 ku。     

甜菜夜蛾多核壳型核型多角体病毒vp39基因的克隆与表达

参照苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV)衣壳蛋白基因vp39的序列设计引物,采用PCR技术扩增了甜菜夜蛾核型多角体病毒的约1．3kb片段,通过将片段亚克隆至原核表达载体pET-28构建出重组表达质粒pET-Se39,以pET-Se39转化E.coli BL21。经IPTG诱导后,SeMNPVvp39基因高效表达,SDS－PAGE分析显示表达产物的分子量为39KD,并且表达量在IPTG诱导4h达到最高水平。／     

禽多杀性巴氏杆菌X-73株ompH基因的克隆和表达

以禽多杀性巴氏杆菌国际标准株X-73基因组DNA为模板,采用PCR扩增得到编码信号肽除外的成熟外膜蛋白H的ompH基因,将ompH基因克隆至pMAL-p2X表达载体中,构建重组表达质粒pMAL-p2X-ompH,转化大肠杆菌BL21,用SDS-PAGE电泳检测IPTG诱导后的表达蛋白.DNA测序结果表明ompH基因片段大小为1 002 bp,与已报道的ompH基因的核苷酸序列完全相同、而SDS-PAGE结果显示表达分子质量约为78 ku,与预期的融合蛋白MBP-OmpH分子质量相符,表明成功构建出原核表达质粒并实现了目的蛋白表达,为进一步开展禽多杀性巴氏杆菌保护抗原的研究奠定基础.     

人可溶性增殖诱导配体在大肠杆菌中的表达、纯化及生物活性鉴定

人增殖诱导配体在促肿瘤细胞增殖以及自身免疫性疾病中具有重要的作用．从GenBank中查出人APRIL的序列号（AR）46888），根据其胞外可溶部分序列设计引物，采用RT-PCR技术从健康人新鲜血液单核细胞（PBMCs）总RNA中克隆出人sAPRIL cDNA，将该cDNA克隆人原核表达载体pET30a，经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高效表达，经SDS—PAGE后在17000左右有一明显的表达条带，该蛋白主要以包涵体形式存在，表达量达45％左右，将包涵体蛋白变复性后进行细胞生物活性实验，为进一步研究其临床应用奠定了基础．     

赤红球菌JDM312环己酮单加氧酶的原核表达及检测

通过酶切法从重组质粒pUC18-chnB中得到编码环己酮单加氧酶的chnB基因序列,将其定向插入原核表达载体pQE30中,构建重组质粒pQE30-chnB,转化到大肠杆菌BL21中并诱导表达目的蛋白,用SDS-PAGE电泳检测表达产物.测序结果表明chnB基因大小为1 623bp,编码由540个氨基酸残基构成的多肽.S...     

中国白兔IL-6基因的分子克隆及其表达研究

运用RT-PCR技术对用ConA刺激的中国白兔外周血淋巴细胞(PMBCr)进行了扩增,将纯化后的PCR产物克隆入pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果中国白兔IL-6基因全长726 bp,编码242个氨基酸,其中前26个氨基酸残基构成信号肽序列.与不同物种IL-6基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列有一定的差异.在推导的中国白兔IL-6氨基酸序列中,在108-110位存在1个潜在的N-联糖基化位点,同时存在9个Cys残基.将pTIL-6双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETIL-6,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行了诱导.结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为29.5kDa的重组目的蛋白.经凝胶薄层扫描,目的蛋白表达量可占菌体蛋白的16.2%.     

氧化还原因子-1的原核表达纯化及其活性鉴定

为建立氧化还原因子-1(Ref-1)的原核表达系统,将经过酶切后的人源Ref-1编码片段定向克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了pGEX-4T-3/Ref-1原核表达载体,重组质粒转化至BL21(DE3)工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组工程菌表达可溶性融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepha-rose 4B)亲和纯化重组蛋白,透析后用聚乙二醇8000(PEG8000)浓缩,获得纯度达92%的融合蛋白,产率为3.7 mg/L,融合蛋白占菌体总蛋白的6.8%.蛋白质印迹(Western blot)显示该蛋白可以被抗体特异性识别,证实其为GST-Ref-1融合蛋白.GST-Ref-1蛋白体外增强了激活蛋白-1(AP-1)的DNA结合能力,并能拮抗H2O2造成的AP-1氧化损伤.     

红斑丹毒丝菌C43065株spaA基因的克隆和表达

通过PCR从红斑丹毒丝菌C43065株基因组DNA中扩增出编码信号肽除外的成熟SpaA蛋白基因spaA,将其克隆到表达载体pET32a的BamHⅠ和Hind Ⅲ位点上,构建重组表达质粒pET-spaA,转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达N端带有Trx标签的融合蛋白rSpaA,SDS-PAGE检测表达蛋白.DNA测序结果表明,spaA基因大小为1794 bp,编码由597个氨基酸残基组成的成熟SpaA蛋白,SDS-PAGE结果显示在大肠杆菌BL21中成功表达了分子量约为86 kDa的重组rSpaA,为进一步开展SpaA保护区域的研究奠定基础.     

Cloning, sequencing and expression of a swine IgG H chain gene inE. coli

A DNA fragment about 1.5 kb has been isolated from spleen of adult Chinese swine by RT-PCR. The DNA fragment encodes immunoglobulin IgG H chain gene. Sequencing analysis showed that the DNA fragment is 1 425 bp long, complete CDS. The C region of the gene has been classified as Subclass Ig γ3, and is the same as reported by Sun et al., but V region of the present gene is 42 bp less by comparison. The gene has been ligated into expression vector pET-3b (NSEB)( - ). A protein about 52 ku has been expressed in E. coli with an expression level of about 21 % .