斑马鱼cGnRH-Ⅱ的基因克隆与序列分析

从斑马鱼脑组织提取总RNA,应用RT--PCR方法克隆eGnRH cDNA,其长度为646bp,包括一个258bp开放阅读框;编码的cGnRH-Ⅱ前体为86个氨基酸残基,由一个信号肽、GnRH十肽和一个由蛋白水解位点（Gly—Lys—Arg）连接的促性腺激素释放激素相关肽（GAP）组成;其中信号肽和联接肽的长度分别为24和49个氨基酸．该eDNA编码的cGnRH-Ⅱ的前体氨基酸序列与其他物种的cGnRH-Ⅱ前体一致．表明物种问cGnRH—Ⅱ cDNA的蛋白编码区高度保守,而非编码区的保守性程度很低．进化分析表明,斑马鱼与鲤鱼、鲫鱼、拟鲤、黑头软口鲦等淡水的鲤科鱼类的同源性较高．     

斑马鱼Nfatc3基因多克隆抗体的制备及检测

为了在斑马鱼模型中更深入地研究Nfatc3蛋白在心脏发育中的功能,采用PCR技术扩增斑马鱼Nfatc3基因的部分编码区并插入pET-28a表达载体中,之后将重组质粒转入大肠杆菌（E.coli）通过IPTG诱导表达His-Nfatc3融合蛋白,对该融合蛋白采用Ni-IDA凝胶柱层析纯化后,免疫新西兰兔制备了多克隆抗体,并用western blotting对抗体进行分析.结果表明获得了高效价的特异性兔抗Nfatc3多克隆抗体.这为Nfatc3功能的进一步研究奠定了基础.     

黑脊倒刺鲃scp3基因的克隆及其表达

为了从分子水平上研究鱼类生殖细胞发育的机制,首次从重要的经济养殖鱼类黑脊倒刺鲃中克隆出了生殖细胞减数分裂Ⅰ相关基因scp3的部分同源序列scscp3:该序列长477 bp,编码159个氨基酸.经比对发现,其编码的蛋白序列与斑马鱼scp3蛋白等具有高度的同源性.不同组织RT-PCR结果显示:scscp3基因仅在生殖细胞中...     

4种促性腺激素释放激素抗体的制备、鉴定和纯化

用3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯(MBS)法将人工合成的4种不同来源的促性腺激素释放激(GnRH)(即章鱼GnRH、海鞘GnRH-Ⅰ、七鳃鳗GnRH-Ⅰ和七鳃鳗GnRH-Ⅲ)分别与匙孔戚血蓝蛋白(KLH)偶联后作为抗原,免疫新西兰大白兔获得GnRH抗体.用间接ELISA方法检测抗血清效价,并用Western blot鉴定其特异性.制备抗原肽亲和纯化柱,纯化多克隆抗体.结果显示,4种多克隆抗体效价高达1∶500 000(体积比),并能和相应的GnRH多肽特异性结合,纯化后的抗体在SDS-PAGE显示为单一条带.通过上述方法,获得4种高效价、高纯度的GnRH抗体,为低等动物GnRH的研究提供了理论依据.     

大熊猫核糖体蛋白L34基因cDNA克隆与蛋白特性

为进一步研究RPL34的结构基因,也为更深入开展大熊猫分子生物学研究积累科学资料,本研究采用RT-PCR方法,首次成功克隆了大熊猫的核糖体蛋白L34基因的cDNA序列,对克隆序列进行了测序及初步分析,并利用RPL34蛋白构建系统树.结果表明:大熊猫RPL34基因的表达序列全长为379 bp,ORF为354 bp,编码117个氨基酸的蛋白质,该蛋白分子量为13.292 9 kD,等电点(pI)为11.48,含有5种类型共11个功能位点.进一步分析发现,该基因与已报道的人、牛、褐家鼠、小家鼠、非洲爪蟾和斑马鱼等物种的编码序列及其编码的氨基酸序列同源性很高,蛋白质分子量、pI非常接近,功能位点基本相同,说明核糖体蛋白L34基因及其编码蛋白在进化过程中非常保守;进化树分类结果与传统分类一致,表明L34蛋白能很好的反映物种间的进化关系.     

斑马鱼CFL基因的克隆、多克隆抗体的制备及分析

在心脏发育过程中,相关基因的正常表达是有功能心脏形成的关键．斑马鱼CFL基因是从斑马鱼胚胎的cDNA文库中克隆出来的一个心脏发育候选基因．生物信息学分析表明：CFL基因编码278个氨基酸,含有一个CXXC结构域．为进一步研究该基因的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了该基因．将所得片段插入原核表达载体pET-28a载体中,经测序鉴定正确后转化入Rosetta菌株中,用IPTG诱导表达出pET-28a－CFL融合蛋白,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71％,融合蛋白相对分子质量约为30kD．经包涵体纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体．经验证,具有较好的特异性和较高的效价,可以用作western－blot免疫印迹等实验分析．     

nestin启动子驱动微管蛋白-EGFP载体的构建及其在神经干细胞中的应用

目的:构建巢蛋白nestin启动子驱动的微管蛋白表达载体,并在斑马鱼及大鼠神经干细胞中正确表达,为实现神经干细胞/神经前体细胞中微管骨架的动态观察和研究提供工具.方法:设计引物扩增斑马鱼基因组DNA中nestin基因上游启动子-952 bp片段并克隆测序;通过PCR获得斑马鱼EGFP-α-Tubulin融合蛋白序列,构...     

草鱼肌肉生长抑制素cDNA克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,从草鱼肌肉组织中克隆出MSTN cDNA序列,长度为1764 bp,编码区为1128 bp,共编码375个氨基酸.前体蛋白包括信号肽序列、N端前肽区、蛋白酶水解位点RIRR及C端活性区（含9个保守的Cys残基）.多重序列比较表明,草鱼与斑马鱼、黑头软口鲦之间的MSTN序列同源性在94%以上,与其它...     

大黄鱼Rab11基因的克隆与表达分析

克隆了大黄鱼小G蛋白家族中的Rab11基因,测序查明其cDNA序列全长1373 bp,其中5’非编码区为129 bp,3’非编码区为587 bp,开放阅读框为657 bp,编码218个氨基酸;其氨基酸序列与罗非鱼、斑马鱼等鱼类Rab11蛋白序列同源性在95％左右,与人类、大熊猫等物种的同源性也达到90%以上。Rab11基因在大黄鱼脾脏、鳃、肾脏、皮肤、肝脏、血液、肠、心脏和胃9个组织中均有表达,在血液、肝脏中表达量最高,在胃中表达量最低;溶藻弧菌刺激后大黄鱼肝脏、肾脏和脾脏组织中Rab11基因的表达量均明显上调,提示Rab11在大黄鱼的抗病免疫反应中有着重要的作用。     

斑马鱼Cyclin C的cDNA克隆及其在发育过程中的表达

细胞周期蛋白C(cyclin C)与细胞周期依赖性蛋白激酶cdk8结合,通过磷酸化RNA 聚合酶 II 和 TFIIH调控转录.在脊椎动物胚胎发育过程中有关细胞周期蛋白C合子型转录激活机制尚知甚少.本研究克隆了斑马鱼细胞周期蛋白C基因,并用Northern杂交和整体原位杂交技术检测其在胚胎发育过程中的表达状态.结果显示,斑马鱼细胞周期蛋白C高度保守,与人细胞周期蛋白C有88％的蛋白序列同源;斑马鱼细胞周期蛋白C在母型期开始表达,其表达伴随中囊胚转换时期的合子型转录激活以及整个胚胎发育过程.     

大熊猫核糖体蛋白S12亚基基因(rpS12)的cDNA克隆及序列分析

根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白S12亚基基因(rpS12)的相关信息设计引物,运用RT-PCR技术,从大熊猫的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白S12亚基基因的表达序列,对其进行了克隆、测序及分析.结果表明:大熊猫核糖体蛋白S12亚基基因的表达序列全长为422bp,开放阅读框(ORF)为399bp,编码132个氨基酸的蛋白质,该蛋白的相对分子质量为1.45×104,PI为6.81,含有1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,3个N-豆蔻酰化位点和一个核糖体蛋白S12 signature位点.该基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物有很高的相似性.     

斑马鱼SAA基因克隆及表达分析

利用巢式PCR(nest PCR)的方法克隆斑马鱼血清淀粉样蛋白A基因,并进行生物信息学分析.实时荧光定量PCR结果显示:SAA在斑马鱼胚胎发育时期的表达量呈现明显的“增长—稳定—增长”趋势.成鱼组织分布中,SAA在11个斑马鱼组织中均能检测到,在心脏和肝脏中相对高表达.     

MAGE家族新成员Restin入核分子机制的初步探讨

restin是该实验室于1999年从维甲酸诱导分化的白血病细胞HL-60中克隆得到的一种黑色素瘤相关抗原（MAGE）家族的新基因,初步验证其生物学功能为阻滞细胞周期进程。利用生物学软件预测该基因所编码蛋白的N端含有一非典型二分裂核定位信号序列（nuclear localization signal,NLS）,且预测结果显示Reslin入核可能与核转运蛋白imponjn αⅡ的作用密切相关。因此克隆并鉴定了针对NLS等结构域的一系列截短体以及pACT—impotin α Ⅱ,利用细胞双杂交技术对其进行相互作用以及作用部位的检测。结果证明Restin的入核确实与核定位信号序列以及核转运蛋白的相互作用有关。     

绿色木霉CBHⅡ基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

采用反转录聚合酶链式反应的方法从绿色木霉中克隆得到纤维二糖水解酶Ⅱ(CBHⅡ)的编码基因cbh2.将该基因片段接入酿酒酵母整合型表达载体pScIKP中,得到重组质粒pScIKP-cbh2.电转化酿酒酵母菌株,通过G418浓度梯度筛选出高抗转化子.采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测CBHⅡ蛋白的表达,并采用羧甲基纤维素糖化力法检测重组CBHⅡ的酶活.实验结果表明:该基因大小为1416bp,编码有472个氨基酸残基,并已将序列提交GenBank,登录号为 DQ864992.SDS-PAGE分析发现重组CBHⅡ成功分泌到了胞外,其相对分子质量约为70000.培养液中的酶活最高可达7.71U/mL,其作用的最适pH值为5.0,最适反应温度为65℃,且具有较好的热稳定性.     

IGF-Ⅱ在原核生物中的表达

胰岛素生长因子IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ在机体的许多组织中都有表达,具有促进细胞生长和分裂等的多种生物学功能。在本研究中,我们采用RT-PCR法克隆和扩增到了IGF-Ⅱ基因,通过双酶切、胶回收纯化、连接后得到了pET21b-IGF-Ⅱ重组质粒载体,然后将其转化DH5α中,经IPTG诱导后表达的重组蛋白经纯化,并用Western blot检测,显示重组质粒pET21b-IGF-Ⅱ编码一个约25kD的外源蛋白。     

应用酵母双杂交系统筛选与Spr2相互作用的蛋白

Spr2在斑马鱼胚胎发育过程中的中胚层和外胚层中表达,它可以通过调控Fgf信号通路来调控斑马鱼中胚层的发生.为了进一步揭示Spr2调控Fgf信号通路的分子机制,本文通过酵母双杂交系统在斑马鱼早期胚胎cDNA文库中筛选可能与Spr2相互作用的蛋白,以酵母融合的方法在6.3×106个转化子中筛选到78个阳性克隆,测序鉴定后最终得到Pairedboxgene6a、mSin3A-associatedprotein130等11种可能与Spr2蛋白相互作用的蛋白,通过结果分析推测Spr2可能通过fgf8参与Fgf信号通路的调控.     

生物信息学在直肠癌相关基因分析中的应用

目的,利用生物信息学方法研究直肠癌相关基因的结构与功能。方法:选择一条在直肠癌和正常组织有差异表达的表达序列标签(EST),利用生物信息学方法,对其进行结构与功能的分析。结果:电子克隆了其全长cDNA序列并预测其编码蛋白为SETprotein。结论:利用生物信息学及网络资源可作为克隆研究基因的新方法。     

小麦泛素融合降解蛋白基因全长cDNA的克隆及分析

实验利用RT-PCR技术，在小麦矮苏3品种中克隆了1个编码泛素融合降解蛋白基因的cDNA，并且含有完整的5′端，将该基因命名为Tufd1，利用RACE技术克隆了该cDNA的3′端。根据这2段cDNA克隆，设计特异引物，利用RT-PCR扩增出了Tufd1完整的开放读码框(ORF)，其编码区长948bp，编码315个氨基酸的多肽，在NCBI中运行BLAST。分析表明，Tufd1蛋白同拟南芥的UFD1蛋白有74％的同源性，在所编码的多肽链的N-端有UFD1保守结构域，可作为催化蛋白降解的信号。     

三疣梭子蟹热休克蛋白70的基因克隆

本研究以三疣梭子蟹为实验对象,运用RT-PCR和RLM-RACE的方法,克隆到热休克蛋白70的基因,其长度为2246bp,含有1956bp的编码区,编码651个氨基酸,命名为ptHSP70.和其它物种HSP70s氨基酸序列进行同源比较,存在高度的同源性,表明这个蛋白属于热休克蛋白HSP70家族的成员.此次所获得的热休克蛋白70基因,将为研究HSP70s与水生生物抗逆性的关系打下基础.     

水稻条纹叶枯病毒天津分离物中病害特异性蛋白编码基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR的方法,对水稻条纹叶枯病毒天津分离物的病害特异性蛋白编码基因进行了扩增,将其克隆到pUCm-T载体后进行序列测定与分析.结果表明,该病毒分离物的病害特异性蛋白编码基因的开放阅读框由537个碱基组成,编码的蛋白含178个氨基酸.与GenBank中已有的病害特异性蛋白编码基因进行序列比对,其与分离自北京双桥的SQ、河南原阳的YY、辽宁盘锦的PJ翻译产物只有143位的一个氨基酸的差异.