分子生物学方法在微生物生态学研究中的应用

由于传统分离培养微生物的局限，分子生物学技术避开了传统微生物培养分析的环节，直接从样品中抽取总DNA，然后通过PCR扩增及其相关技术、核酸杂交技术、RNA基因序列分析等方法对直接提取的总DNA进行分析，了解其中微生物信息．这些通过遗传物质进行研究的分子方法，为微生态的研究开辟了新的途径，并已经得到广泛的应用．     

海水养殖沉积环境微生物总DNA的提取方法研究

传统的微生物分离与培养技术无法揭示微生物群落的动态变化.为了阐释虾池沉积环境微生态格局的原始组成情况,本研究先以TENP缓冲液去除沉积物中的腐殖酸,继之以溶菌酶-SDS温和裂解,其总DNA的提取效率达90%以上,所获DNA产量达2～20 μg/g沉积物(湿),片段大小均在23 kb左右,不经纯化即可直接进行PCR扩增和限制性酶切.以该DNA为模板进行PCR-DGGE分析,揭示了虾池沉积物丰富的微生物多样性.该方法是一种适用于虾池沉积物总DNA提取的简便、可靠方法.     

南极土壤微生物宏基因组文库构建及其抗肿瘤活性初探

微生物代谢产物是药物的重要来源之一，然而采用传统的分离培养筛选的手段仅能对不到1%的微生物资源进行研究开发.通过构建环境样品微生物宏基因组文库能突破人工培养的瓶颈，直接克隆到完整的次级代谢产物合成基因簇，并从中寻找新的药物和活性次生代谢产物.实验直接提取南极中山站排污口土壤样品中微生物总基因组DNA，以黏粒(SuperCos 1)为载体，构建了宏基因组文库，获得了约27 000个克隆子，平均插入片段在35kb以上，覆盖了至少946Mb的微生物基因组信息.通过差异性DNA修复试验(DDRT)法对该文库进行筛选，获得13个具有抗肿瘤活性的克隆子，并采用MTT法对其中活性较高的克隆子进行细胞毒活性测定，表明克隆子AE3对卵巢癌细胞具有明显的生长抑制作用.     

分子生物学技术在微生物多样性研究中的应用

用传统的方法很难鉴别微生物的差异,分子生物学技术就很好地解决了该问题,尤其适合于常规方法失效的情况下.该技术的主要程序是:先从微生物中直接提取DNA,对DNA进行PCR(PolymericChain Reaction)或RAPD(Random Amplification of Polymorphic DNA)扩增,然后进行DGGE(DenaturingGradient Get Electrophoresis)电泳,或RFLP(Restriction Fragment Lergth Polymorphism),ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assav)分析等,之后进行测序,测序结果与网上基因库进行对比,来确定样品中微生物的种类.此方法是直接从样品中提取总DNA,中间不会造成菌株的富集或衰减,具有很高的准确性.此方法对微生物多样性的深入研究很有效.     

遗传指纹图谱技术对微生物群落的分析

微生物培养技术无法获得自然生境中99％以上的微生物，而可培养的微生物也仅提供极少的形态学线索，鉴定和生理学特性经常是模糊的。分子生物学技术对不可培养微生物的研究，开启了探索微生物多样性和新资源的大门。DNA杂交、rRNA分子标记测序等已经成为研究分子微生物生态学的常规手段，可以鉴定和描述微生物群落的种群，但却不适于探索微生物复杂群落的动力学。遗传指纹图谱技术允许同时进行多样本的分析，可比较不同生境和随时间变化的微生物群落行为，是传统手段的有力补充。     

羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物高效分离基因组DNA

分别以常量的大肠杆菌和微量的嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)为实验对象,研究羧甲基壳聚糖磁性纳米复合物载体对基因组DNA的分离纯化,对分离的大肠杆菌基因组DNA直接采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析,分离的A.ferrooxidans基因组DNA则直接作为硫化物质体醌氧化还原酶基因片断的PCR扩增模板.研究结果表明:采用磁性纳米复合物法,其制备DNA的时间是传统方法的1/3,具有快速、简单的优点,在微量样品DNA提取中,由于其富集提取DNA,并提高了PCR的灵敏性功能,比传统方法优越,可用于食品卫生致病微生物的检测、法医鉴定以及极难培养的微生物的菌种鉴定.     

磷脂脂肪酸谱图分析方法及其在环境微生物学领域的应用

 传统的微生物鉴定和群落分析方法建立在微生物纯种培养分离的基础之上。但是在自然环境中,99%以上的微生物未能通过人工培养,在微生物的分析和研究中存在很大的局限性。与传统的基于培养基的微生物分离技术以及生理学方法和分子生物学方法相比,基于现代生物化学技术——脂肪酸可作为生物标记物而发展起来的磷脂脂肪酸谱图分析方法(PLFA)具有不依赖于培养体系影响,能够直接有效地提供微生物群落中的信息;脂肪酸成分不受质粒数量的影响,试验结果客观、可靠;试验条件要求低、操作难度小、测试功能多;由脂肪酸谱图可以对整个微生物群落进行定量描述等诸多优点,在环境微生物学领域的应用日趋广泛。本文综述了PLFA谱图分析方法及其在环境微生物学领域的应用,包括在微生物检测、鉴定和微生物多样性研究中的应用。     

太白红杉总DNA的快速提取方法

对太白红杉总DNA提取方法进行了探讨，并对其不同部位和器官、不同处理方式材料进行了提取实验研究．通过琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶处理等方法对所提取的DNA样品进行检测．结果表明，改良后的CTAB法，对于太白红杉总DNA的提取是一种良好的简单易行的方法，无论是烘干后的材料还是新鲜材料提取的总DNA中基本没有蛋白质及酚类污染．该方法可在短时间内获得大量的DNA样品，并可根据需要对样品进行适当操作．     

一种河口沉积物总DNA的高效提取方法

研究主要目的是从河口沉积物中提取高质量DNA,为后期应用分子生物学技术研究河口沉积物微生物功能基因及种群分析等奠定基础。用CTAB-SDS-冻融法,样品预处理-CTAB-SDS-冻融法,样品预处理-CTABSDS-冻融-DNA重沉淀法和土壤总DNA提取试剂盒法提取3种河口沉积物总DNA,通过DNA琼脂糖凝胶电泳、DNA纯度和浓度及16S rDNA的PCR扩增分别对这4种方法进行评价。结果显示,样品预处理-CTABSDS-冻融法-DNA重沉淀所提取的DNA质量最高,可以用于后续的分子生物学研究。     

纸表微生物的简易模型与DNA提取方法评价

微生物是造成古籍善本和纸质档案损伤的主要原因之一,近年来不依赖于实验室培养的高通量测序成为研究纸表微生物的常用方法.但是纸表微生物的含量往往偏低,DNA提取常依赖于昂贵的进口试剂盒,成本过高.本文首先构建了一个标准的纸表微生物体系,用传统棉签擦拭法获取该纸表微生物样品,再利用改良的化学法、机械破壁法、酶消解法3种方式提取样品中微生物总DNA并比较其浓度与纯度,最后利用PCR扩增验证提取效果.结果表明,酶消解法提取所得浓度最高,化学法次之,机械法最低,但DNA纯度正好相反.经PCR验证,化学法的扩增效果较好.综合上述指标,改良的化学法更适宜提取纸表微生物样品中的总DNA.     

快速高效堆肥处理城市污泥微生物多样性研究

采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术对城市污泥堆肥工艺中微生物种群多样性进行初步研究，结果表明污泥中的微生物种群有显著的改变，同时对堆肥后污泥中的微生物进行了尝试性探讨，为城市污泥微生态和高效堆肥工艺的研究提供了新的实验依据。     

分子生态技术在微生物硝化及反硝化研究中的应用

对微生物硝化、反硝化的机理及作用的相关酶及近年来的研究热点问题进行了探讨。综述了分子生态技术在微生物群落结构分析的操作步骤及应用情况, 分析了荧光原位杂交、变性梯度凝胶 电泳及末端限制性片段多态性技术的原理、操作流程、优缺点及其在硝化和反硝化中的应用。以往 的研究表明分子生态技术已成为环境中硝化和反硝化过程及机理研究的有力工具。     

降解2-氯酚厌氧污泥中微生物种群结构研究

采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术，研究Fe^2＋，Ni^2＋金属离子对经2-氯酚（2-CP）驯化后的厌氧生物反应器颗粒污泥的微生物种群结构的影响．结果表明，经2-CP驯化后，厌氧体系微生物多样性减少，产生了能适应或降解2-CP的主要菌群发光杆菌属、埃希氏菌属和志贺氏菌属．投加Fe^2＋，Ni^2＋后，降解2-CP的厌氧污泥微生物多样性均呈减少趋势，其中，加Fe^2＋后的厌氧体系微生物多样性明显减少，并产生新的条带，经分析，证明为专性厌氧梭菌属．     

环境生物工程技术的发展前景展望

环境生物技术是一门利用微生物介质为人类提供服务的技术科学，其核心思想是依据各类微生物的生态活动规律，从中寻找最有效的能解决目前一些环境问题的途径，如稀释污染物、截留废物中的可循环利用资源等．在过去15年里，分子生物技术的广泛使用，为逐步掌握微生物生态活动规律提供了可能，如：它们是如何自组织繁衍的，不同类体之间是如何相互影响的；同时，一些新的数学模型方法和新材料的尝试使用，也极大地拓宽了学科研究的手段．目前，有两种力量正在推动该学科的进行，一是其他学科领域的发展所带来的“推力”，二是社会的环境安全需求所产生的“拉力”．为了利用这种大好的发展时机，未来学科的研究耍注意以下4个方面：①把解决水和能源可持续发展问题放在首要位置；②开发和采用更有效的分子技术工具去揭示微生物的生态活动规律；③综合利用分子技术工具、模型分析工具和采用新材料去努力解决实际环境问题；④耍注重生物膜技术的研究．还提供了几个案例说明了如何把这4个方面的思想贯彻到实际研究之中。     

石油微生物16SrRNA基因PCR扩增研究

掌握石油微生物的16SrRNA基因保守区的扩增方法是先进分子水平鉴定微生物种类一种有效的实验方法。通过研究利用分子生物技术提高对石油微生物的了解,进行未来对石油的开采,摸索出石油微生物的DNA提取方法,16SrRNA基因的PCR扩增反应条件的研究进而初步鉴定菌种类型。本文是以大庆采油三厂分离纯化的石油微生物为实验材料,摸索合适的石油微生物基因组DNA的提取方法及合适的PCR扩增条件和反应体系,在本实验室后续开展石油微生物在分子水平方面的实践指导中有重要意义。     

植食性昆虫、植物和共生微生物的功能关联

植食性昆虫和植物均能与微生物形成密切关系，它们各自的生态功能及相互关系也常被共生微生物所影响。近年来，随着分子水平研究方法的进展，植食性昆虫和植物中很多可遗传共生微生物（细菌、真菌等）被发现。共生微生物能够在营养、生殖、防御和解毒等方面给宿主带来显著影响，并与宿主形成竞争、互利或寄生等关系。植食性昆虫体内的含菌胞、肠道、血淋巴、唾液腺等常含有重要功能的共生微生物。新的分子生物学手段和高通量测序技术的应用使得我们能够增加对宿主和共生微生物（即使处于低丰度）之间关系的了解。本文尝试总结了植食性昆虫和植物共生微生物的多样性及其关系、昆虫和植物互作机制、昆虫共生菌解毒植物毒素等方面的近期证据，突出强调了应以系统观思维来理解共生微生物、植食性昆虫和植物间的功能关联，并就将来值得研究的问题提出了建议。     

分子生物学方法在微生物生态学中的应用

给出了植被对微生物群落结构影响的研究结果,同时较详细地介绍了从土壤样品中提取ＤＮＡ以及对ＤＮＡ进行克隆,并获得微生物克隆群落的方法和步骤。应用该方法在获得高产量ＤＮＡ的同时,获得了多样性极高的微生物克隆群落。     

食源性致病菌溯源分型技术研究进展

1997年以来,欧盟为应对“疯牛病”问题逐步建立并完善食品安全管理制度,但是目前食品安全仍然是全世界最为关注并且积极寻求解决方案的重大议题之一,尤其是食源性致病菌引起的食品问题常年严重危害人类的生命健康和经济秩序。目前各国寻求各种技术解决食源性疾病问题,但由于微生物传染源难以监测控制,很多情况下需要针对发病人群进行后期的致病菌溯源,通过溯源可以总结经验,避免相似问题再次发生。细菌分型技术是食源性致病菌溯源技术的重要内容,包括表型分型和分子分型两种。常见的表型分型种类有血清学分型、噬菌体分型、耐药性分析等,分子分型类别有PFGE、16SrRNA序列分型、RFLP、基于测序方法的MLST等。