重组人粒细胞集落刺激因子在Escherichia coli中的表达研究

根据人天然粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）基因序列设计出引物,通过ＲＴ－ＰＣＲ从人外周血单个核细胞ｍＲＮＡ获得Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段,将该片段与原核表达载体ｐＴ７构建成重组体,导入大肠杆菌后发现天然Ｇ－ＣＳＦｃＤＮＡ表达量并不理想,这可能是由于天然ｈＧ－ＣＳＦ５’端Ｇ＋Ｃ的比例过高,使转录后的ｍＲＡ很容易形成二级结构而影响翻译起始,因此在大肠杆菌中很难获得高效表达,根据密码子简并性原则,在不改变编码氨基酸顺序的前提下,通过重新设计ＰＣＲ引物,将ｈＧ－ＣＳＦ的前３个氨基酸密码子中的几个ＧＣ碱基作了改动,获得了新的ｃＤＮＡ突变体,将其与ＰＴ７的重组导入大肠杆菌,获得了高效表达。     

重组人粒细胞集落刺激因子的摇瓶发酵研究

目的 优化重组大肠杆菌生产人粒细胞集落刺激因子摇瓶发酵工艺条件。方法 利用摇瓶系统地考查rhG-CSF茵株培养温度、诱导时机、pH值、溶氧、种子茵龄、接种量等工艺条件，选择出最佳的摇瓶培养条件。结果 最佳条件为：培养温度30℃；初始pH值在7．0～7．2；装液量20％；摇床转速180r／min；种子菌龄在A600为1．0～1．5时接种，并在对数生长前期(A600=1．0)时诱导4h。在此优化的培养条件下，在摇瓶中使用优化后的M9培养基时，rhG-CSF的表达量占茵体总蛋白的36．5％，光密度达5．85。结论 构建的rhG-CSF工程菌发酵的稳定性和重复性良好，可作为rhp-CSF的大规模生产提供可靠的放大依据。     

重组人粒细胞集落刺激因子的纯化与复性

人粒细胞集落刺激因子 ( h G-CSF)有促进粒系造血干细胞增殖分化及增强成熟细胞功能的作用 ,广泛应用于医疗上癌症化疗、骨髓发育不良、再生障碍性贫血和先天性、特发性等嗜中性白细胞缺乏症的治疗。目前 ,h G-CSF主要来源工程菌发酵产生 ,浓缩于菌体包涵体之中 ,包涵体之中的 h G-CSF是没有生物活性的 ,必须经过溶解、分离、纯化和复性才有活性 ,有关 h G-CSF纯化和复性的研究实验如下 :一、材料与方法1 .包涵体来源 :上海三维公司赠送 ,由工程菌经发酵、收集菌体、破菌、离心和沉淀获得。2 .包涵体的洗涤 :主要是洗去包涵体表面的…     

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子菌种稳定性研究

 为了解含重组质粒的大肠杆菌菌种连续传代及发酵罐培养中质粒的遗传稳定性,将GM-CSF菌种在含氨苄青霉素的琼脂平皿上连续划线传代培养,以及在不含安苄青霉素的培养基中进行发酵罐培养和42℃诱导表达.结果显示pBV220GM-CSF工程菌在氨苄青霉素选择压力下连续传代10,25,50和100次后质粒稳定、不丢失,而在不含氨苄青霉素的培养基中进行发酵罐大规模培养42℃诱导表达时,质粒稳定性下降,质粒易丢失,其表达量随诱导时间而变化.     

粒细胞集落刺激因子对甘油诱导小鼠急性肾功能衰竭的保护作用

目的:探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对甘油诱导的小鼠急性肾功能衰竭的保护作用。方法:将φ=50%的甘油注射于停止饮水18h的C57BL/6j小鼠后肢肌肉内(11 6mL/kg),诱导小鼠产生急性肾功能衰竭;于注射甘油3h后,实验组小鼠每天腹腔注射G-CSF10μg/kg,连续注射5d,对照组用等量的生理盐水进行注射,正常组不作任何处理;在注射甘油72h和168h后,分别检测小鼠血清的肌酐和尿素氮含量,观察小鼠肾脏组织的病理变化。结果:在注射甘油后第72h,实验组血清的肌酐和尿素氮分别为(37 2±2 17)μmol/L和(15 6±1 60)mmol/L,显著低于对照组(P<0 01),略高于正常组(P>0 05);肾组织切片,HE染色,显微镜检查发现肾近曲小管上皮细胞变性坏死病灶呈散在分布(++),明显较对照组(++++)轻。在第168h,实验组血清的肌酐和尿素氮分别为(32 3±3 46)μmol/L和(10 90±1 24)mmol/L,接近于正常(32 2±2 09)μmol/L和(12 25±1 11)mmol/L;肾组织切片,HE染色,显微镜检查发现肾组织病理改变(+)也接近正常。结论:G-CSF对甘油诱导的小鼠急性肾功能衰竭有保护作用。     

转人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)基因的鱼腥藻的构建

本研究目的是构建转G-CSF基因的工程鱼腥藻Anabaena sp..首先将b型G-CSF克隆于中间载体pRL 439和穿梭表达载体pDC-8上.通过三亲接合转移将穿梭表达载体pDCG-CSF转入鱼腥藻内.通过PCR扩增的方法在转基因鱼腥藻中检测到G-CSF基因的存在.     

t-PA在昆虫细胞中的表达

将含完整阅读框架的人ｔ－ＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ－ｙｔｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ,ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ克隆至昆虫细胞表达转移载体ｐＢａｃＰＡＫ８中,获得重组质粒ｐＢａｃ－ｔＰＡ。应用脂质体共转染法,将ｐＢａｃ－ｔＰＡ和线性化杆状病毒ＢａｃＰＡＫ６ ＤＮＡ共转染Ｔｎ－５Ｂ－１昆虫细胞。经空斑筛选获得１１株重组病毒。经ＰＣＲ鉴定与生物活性测定,获得一株高效表达ｔ－ＰＡ的重且病毒ＢａｃｔＰ     

重组人粒细胞刺激因子对肿瘤化疗后骨髓抑制作用分析

目的探讨不同骨髓抑制时期应用重组人粒细胞刺激因子对化疗后白细胞和中性粒细胞减少的防治作用.方法回顾性分析200例化疗后出现骨髓抑制且应用重组人粒细胞刺激因子的恶性肿瘤患者资料,通过对患者用药前后血常规的检查,观察恢复天数和用药前后白细胞和中性粒细胞计数的变化,比较不同骨髓抑制时期给药后患者的恢复程度,以此评估疗效.结果治疗后患者白细胞和中性粒细胞计数有显著升高,恢复正常值平均需要2.72 d,药物的有效率为96.50%,其中Ⅱ度骨髓抑制患者治愈率可达到100%.结论重组人粒细胞刺激因子对骨髓抑制的疗效明显,不良反应小,安全性高,最佳给药时机为Ⅱ度骨髓抑制时期.     

粒细胞集落刺激因子（G—CSF）对心肌梗死后心室重构与心脏功能的影响

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)能够将骨髓干细胞动员到缺血组织参与组织修复,因而具有治疗心肌梗死的潜力.但是目前国际上对该疗法的效果尚存在争议.为了研究心肌梗死急性期内注射G-CSF对心肌纤维化及心脏功能的影响,将SD大鼠冠状动脉左前降支结扎3h后,皮下注射G-CSF(50 μg/kg/d,共5d)或等量生理盐水.结果显示G-CSF注射5d后,外周血白细胞数量显著增加.3个月后,G-CSF注射显著增加了梗死范围和左心室胶原含量,损害了心脏功能.由以上可见,心肌梗死急性期内给予G-CSF治疗促进了心肌组织纤维化,并导致了心室扩张和心脏功能恶化.     

人生长激素基因在昆虫细胞中表达的初步研究

将人生长激素hGH的cDNA片段克隆在转移载体pVL1393的多角体蛋白基因启动子下游,构成重组转移载体pVL1393hGH,将该质粒DNA与昆虫杆状病毒（AcNPV）DNA共转染秋粘虫（Spodopterafrugiperda）细胞Sf9,通过体内同源重组,hGH基因取代多角体蛋白基因,从而整合到病毒基因组上,经感染昆虫细胞后表达外源hGH基因,通过反复病毒空斑纯化,获不含多角体的重组病毒,利用免疫化学发光法测定hGH表达量达40μg／mL．     

人绒毛膜促性腺激素的纯化及其对小鼠脾细胞产生CSFs的诱导作用

HCG 粗品(10Iu/mg)经乙醇抽提,Sephadex G-100和 SE-Sephadex C-50凝胶过滤后,纯化了800倍,免疫活性达8370Iu/mg.经 SDS-PAGE 鉴定 HCG 的两亚基分子量分别为17000和32000.用纯化的 HCG 制备具有较高滴度的抗 HCG 抗血清.通过软琼脂培养法观察了 HCG 诱导小鼠脾细胞产生 CSFs 的影响,结果表明 HCG 浓度为400Iu/mg时,诱导效应最大。时间依赖曲线以72小时的 CSFs 活力最高.HCG 的诱导作用可以被抗HCG 抗血清完全中和。     

hSOD基因在大白鼠肺上皮细胞中的表达

本文以哺乳动物细胞表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ为运载体,构建了受控于ＣＭＶ启动子的ｈＳＯＤ基因的表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ＿ＳＯＤ,用脂质体转染法转染大白鼠肺上皮细胞Ｌ２细胞后,经抗生素Ｇ４１８选择性培养,获得与细胞染色体ＤＮＡ稳定整合的ｈＳＯＤｃＤＮＡ导入细胞,经ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔｓ和ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｓ分析,结果表明,ｈＳＯＤ在细胞中得到稳定表达,同时测定细胞ＳＯＤ酶活性,ｈＳＯＤｃＤＮＡ导入细胞的ＳＯＤ酶活性是空载体导入细胞和父本细胞的约２倍,并且在选择细胞克隆之后的６０天内是持续的．     

BHIVgag—pol基因在MT—4细胞中的表达

以HIV－1 HXBc2毒株为遗传背景,通过DNA重组技术构建出嵌合有BIV R29gag-pol基因的重组病毒BHIV cDNA。BHIV cDNA经电转染导入人源细胞MT－4后,分别收集第1d到第7d的细胞和培养液上清进行检测。RT－PCR分析证实BHIV的gag基因已得到转录;反转录酶活性测定表明,BHIV中源于BIV的反转录酶已得到正确转录、翻译并加工成熟。这些结果说明重组病毒BHIV cDNA中HIV控制下的BIVgag-pol基因能够的MT－4细胞内正确表达。     

用电穿孔法将外源基因高效导入水稻胚盾片细胞

利用电穿孔法将外源基因导入未经前处理的水稻成熟胚盾惩细胞，质粒为ｐＡＣＴ１－Ｆ，其上带有受水稻肌动蛋白基因ａｃｔｉｎ１启动控制的ＧＵＳ（ｕｉｄＡ）报告基因，电穿孔实验的条件为１００μｇＤＮＡ／ｍｌ缓冲液，３１０Ｖ／ｃｍ场强及９００μＦ电容，通过ＧＵＳ基因瞬时表达实验室证明只需一次脉冲处理便可在一个胚上获得几十个数百个转化细胞，并且发现盾片细胞较胚上其它部位的细胞更易于转化。     

昆虫细胞杆状病毒表达人生长激素的纯化及性质研究

在昆虫细胞杆状病毒中表达的人生长激素，经CM－52离子交换柱层析和Phenyl-Sepharose CL-4B疏水柱层析后，去除了93％杂蛋白。再用CNBr-activated Sepharose 4B亲和柱层析的方法，获得高纯度的生长激素样品。SDS－PAGE结果表明，纯化样品在SDS－PAGE图谱呈现一条带，分子量为22kD。Western杂交结果表明，纯化样品与生长激素标准品有相似的免疫活性。胰肽图谱分析结果显示纯化样品和标准品具有相同的一级结构。DNS－CL测N末端表明，纯化样品的N末端为苯丙氨酸，所有这些性质均与天然人生长激素相同。