向日葵Pst Ⅰ和Mse Ⅰ内切酶组合AFLP标记体系的建立及引物筛选

 为建立并优化适合向日葵的Pst Ⅰ 和Mse Ⅰ 组合的AFLP 技术体系, 为下一步构建遗传连锁图谱及开展分子标记辅助育种奠定基础, 对向日葵基因组DNA 提取方法、酶切连接体系和选择性扩增程序的影响因素进行优化, 并对适合向日葵AFLP 分析的引物组合进行筛选。结果表明, 模板DNA 的提取采用改进CTAB 法, 酶切连接采用一步法反应14 h, 在选择性扩增体系20 μL中, Mg²⁺和dNTP 浓度分别为2 mmol/L 和0.3 mmol/L, 选扩引物的浓度为0.6 mmol/L, 预扩增产物最适稀释倍数为30 倍。同时筛选出了稳定且多态性丰富的48 对适合向日葵AFLP 分析的引物组合。     

黄嘴白鹭遗传多样性AFLP分析方法的建立

以黄嘴白鹭为研究对象,探讨并建立其遗传多样性分析的Pst I/Mse I AFLP分子标记方法.采用黄嘴白鹭13个样品作为一个种群的池DNA,通过对AFLP方法中DNA提取、酶切、连接、预扩增、选择性扩增、电泳和银染等条件进行优化,建立了一套适合黄嘴白鹭的AFLP技术优化体系,为黄嘴白鹭遗传多样性的分析奠定研究基础.     

麦长管蚜实验群种的研究

麦长管蚜是我国华北冬麦区的重要害虫,为制订出防治麦长管蚜的最优决策,我们进行了麦长管蚜实验种群的研究,分析了麦长管蚜与主要环境因子温度、湿度之间的关系,并建立了依赖于温度、湿度的麦长管蚜生长发育模型和内禀增长率模型.为预测麦长管蚜的发生动态提供了依据,为防治麦长管蚜最优决策的提出奠定了基础.     

麦长管蚜实验群种的研究

麦长管蚜是我国华北冬麦区的重要害虫，为制订出防治麦长管蚜的最优决策，我们进行了麦长管蚜实验种群的研究，分析了麦长管蚜与主要环境因子温度、湿度之间的关系，并建立了依赖于温度、湿度的麦长管蚜生长发育模型和内禀增长率模型。为预测麦长管蚜的发生动态提供了依据，为防治麦长管蚜最优决策的提出奠定了基础。     

麦蚜的发生危害规律和综合治理研究

研究明确了我省90年代危害小麦的蚜虫是由禾谷缢管蚜、麦长管蚜、麦二叉蚜组成的混合种群,以禾谷缢管蚜为优势种;在国内首先报道麦长管蚜可以在长江中下游地区越冬,并明确麦蚜的种群空间格局随有蚜株率而变化,为不同密度下抽样技术提供了理论依据.     

大黄鱼(Larimichthys crocea)fAFLP方法的建立

以大黄鱼为材料,探索及优化了影响荧光标记AFLP(fAFLP)分析体系的主要因素.结果表明:内切酶EcoRⅠ与MseⅠ各0.35 U,双酶切350 ng大黄鱼基因组DNA,依次反应4 h可得最佳效果;T4DNA连接酶2.5 U,16℃过夜连接3μL酶切产物与接头时效果最佳;以1μL连接产物作底物,EcoRⅠ与MseⅠ预扩引物分别为0.3μmol/L与1.5μmol/L时预扩效果最佳;预扩产物稀释超过100倍作为选择性扩增的模板时致使某些样品的电泳条带缺失.使用该体系分析了一个野生大黄鱼群体的AFLP片段的多态水平,结果证明该方法简便有效,可用于群体遗传多态性分析.     

重楼属植物AFLP实验体系的建立

通过对影响重楼AFLP-银染技术体系的关键因素作对比研究,建立了一套优化的重楼AFLP分子标记体系.优化的关键因素为:1)DNA采用CTAB法提取更适于重楼的AFLP分析,且从幼叶中提取的DNA纯度和质量最高;2)酶切时间为9h时效果最佳;3)选择性扩增时退火温度为56℃;4)从15对引物中筛选出4对进行选择性扩增,得到扩增条带276条,其中多态性带201条(占72.83%).     

小麦抗病性研究的AFLP分析体系的建立

利用小麦抗白粉病材料，通过对AFLP反应体系中几个主要条件的优化，建立了适合于小麦抗病性研究的AFLP反应最佳体系．实验结果表明，40μL酶切连接反应体系中，用于酶切的基因组DNA为500ng，20μL预扩增反应体系中Mg抖终浓度为1．5mmol／L，引物量为30ng时，其预扩增结果最好，这为下步选扩实验提供了实验条件；同时对扩增产物的银染检测方法进行了探索，获得了最佳的银染方案，所获图谱条带清晰，无背景干扰，便于分析．     

黑木相思双低频酶cDNA-AFLP反应体系的建立

以黑木相思组培苗为实验材料,对影响cDNA-AFLP反应体系的关键因素进行了研究,建立了适用于黑木相思的cDNA-AFLP分析体系.结果表明:适用于黑木相思dscDNA的限制性酶切组合为EcoR Ⅰ和PstⅠ,dscDNA酶切用量为500 ng.用作预扩增模板的连接产物稀释倍数为1倍,用作选择性扩增模板的预扩增产物稀释倍数为50倍.     

小麦品种对春长管蚜抗性的动态分析

采用室内外单蚜网罩饲养试验，系统研究了１０个小麦品种不同生育期长管蚜的抗性动态不同品种对麦长管蚜种群干扰效应。结果表明长管蚜在不同品种上的累积存活率，平均发育因期，产仔率动态及同禀增长率均有明显差异；建立了品种对麦长管蚜种群增长的干扰效应模型，分析了各品种的耐害补偿功能及自然感蚜特性。     

小麦近缘种属对麦长管蚜抗性分析

为寻找小麦近缘种属的抗虫基因,选取中国春(Chinese spring,CS)为背景的异源附加系材料在室内进行小麦苗期对麦长管蚜Sitobion avenae(Fabricius)的抗性鉴定,以蚜情指数为抗性评价标准.结果得到以卵穗山羊草(Aegilops geniculata)为近缘种属附加系的材料具有高抗麦长管蚜的优良性状,且抗虫基因位于1Mg、7Mg染色体上,为进一步研究该材料的抗虫基因定位提供了依据.     

MSAP在水稻害虫白背飞虱中的应用研究

甲基化敏感的扩增多态性分析方法 (MSAP)是在扩增片段长度多态性技术基础上建立起来的主要用来检测样品基因组DNA甲基化情况的一种方法,特别适用于全基因组范围内检测CCGG位点的胞嘧啶甲基化情况,在高等动物和许多植物上已广泛应用,但尚未有在昆虫中应用该方法的报道。从DNA提取、酶切基因组DNA用量、酶切和接头连接时间、电泳图谱显影方法等方面对MSAP方法进行了改进,并在水稻重要害虫白背飞虱上得到成功应用。这为将来在其它昆虫中使用该方法研究基因组DNA甲基化情况提供了一定借鉴和指导价值。且通过比较白背飞虱雌雄性别间和长短翅型间的MSAP图谱,发现雌雄性别间和长短翅型间的基因组DNA甲基化式样都存在明显的差异,说明DNA甲基化可能参与了性别和翅型分化的调节。     

Identification of a protein associated with circulative transmission of Barley yellow dwarf virus from cereal aphids, Schizaphis graminum and Sitobion avenae

Using 2-D electrophoresis and virus overlay assay,a 50-kDa protein(P50)exhibiting specific binding to purified virus particles of BYDV-GAV was found in the protein extracts from Schizaphis graminum and Sitobion avenae,two aphid species transmiting BYDV-GAV.P50 in the extracts of S.graminum was isolated by preparation electrophoresis and electro-eluted proteins from the gel slices for antiserum preparation.After feeding the antiserum through membrane,the transmission efficiencies of S.graminum and S.avenae for BYDV-GAV decreased significantly.It was suggested that P50 should be related with transmission process.Location of P50 was found at the plasma membrane surrounding the accessory salivary gland(ASG) in the head tissues of S.graminum by immunogold-labelling experiment.The ascertainment of the protein associated with virus transmission has a significance influence on further understanding the transmission mechanism and genetic engineering for resistant to vector transmission.     

AFLP的一种改进方法

扩增片段长度多态性技术是一种兼具稳定性及多态检出率高的ＤＮＡ指纹分析技术,具有广泛应用前景,但该技术费用高,操作较复杂,本文对ＡＦＬＰ技术从限制性内切酶水解,扩增条件,检测方法三方面作了一些改进,建立了一磋稳定的和简便易行的实验条件,同时对这种改进的方法对家蚕基因组ＤＮＡ的多态性进行了初步研究,得到了良好的ＤＮＡ的多态性检测效果,不仅分辨力较高,而且带型稳定。     

小麦基因组AFLP技术体系建立的研究

扩增片断长度多态性(AFLP)可靠性强,多态检出率高,因而被认为是最有效的DNA指纹分析技术.利用这一技术,在不需要预先知道DNA序列信息的情况下就可以同时进行多数DNA酶切片段的PCR扩增.以小麦为材料,对AFLP指纹银染技术及实验操作中的关键技巧作了比较详尽的叙述,并建立起了AFLP技术体系.     

白藜芦醇合酶基因的克隆及对毕赤酵母的转化

目的建立白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统。方法通过PCR、限制性内切酶消化、连接、电激等方法,构建表达载体,转化毕赤酵母GS115。结果从葡萄基因组DNA中扩增得到了 1 200 bp目的基因,并克隆至pBS-T栽体;成功构建了表达载体pPIC3．5K／RS;目的基因成功整合进毕赤酵母GS115基因组中。测序及PCR鉴定证明,白藜芦醇合酶基因的毕赤酵母表达系统建立成功。结论所得方法无需高质量的RNA,从而降低了试验条件,达到了快速简便的目的。     

AFLP分子标记在鹀属遗传多样性分析中的初探

利用扩增片断长度多态性（AFLP）技术分析了鹀属(Emberiza)4种鹀(三道眉草鹀Emberi za cioides, 白头鹀Emberiza leucocephala, 白眉鹀Emberiza tristrami, 灰头鹀Emberiza spodocephala)基因组DNA的多态性. 在选取的39对引物中, 有11对能得到重复性好的多态性扩增条带, 每对引物扩增带数为27~76. 共得到535个标记位点, 其中429个为多态位点, 多态位点 比率达801%; 在UPGMA聚类关系图中, 4种鹀聚成一大类, 三道眉草鹀与白头鹀、 白眉鹀与灰头鹀分别两两相聚. 结果表明, AFLP可用于分析鹀属遗传多样性.     

猪呼吸道冠状病毒核衣壳蛋白基因的克隆及原核表达

以RT—PCR法从猪呼吸道冠状病毒(PRCV)感染的ST细胞中得到核衣壳蛋白(N蛋白)cDNA,并以此为模板利用PCR技术完成了N蛋白的基因扩增．通过双酶切、连接、转化等过程构建了猪PRCVN蛋白基因的重组原核表达质粒,表达产物经SDS—PAGE、Western blot检测被确认为GST融合的N蛋白．表达蛋白与PRCV阳性血清间有良好的免疫结合性．