猪卵母细胞体外成熟的研究

从屠宰场收集卵巢,用注射器从卵泡中吸出卵丘－卵母细胞复合体,对猪卵母细胞体外成熟的条件进行研究,根据卵母细胞体外成熟时的核成熟率、胞质成熟及体外受精时精子的穿卵速度,合适的体外成熟培养时间为４２～４５ｈ．卵母细胞周围卵丘细胞的多少及其排列紧密状态与卵母细胞的体外成熟率密切相关。卵泡大小与卵母细胞的体外成熟率有关,大卵泡卵优于小卵泡卵。ＰＭＳＧ促进猪卵母细胞体外成熟。     

小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究

小鼠腔前卵泡在体外生长过程中，于培养液中添加血清，以及ＦＳＨ和胰岛素均对小鼠腔前卵泡的体外生长，体外成熟，体外受精起促进作用，其中以胰岛素的效果最为显著，腔前卵泡的体外成熟率和体外受精率可达６９．４％和８０．６％，但是体外受精后的体外发育率低于加ＦＳＨ的试验组，表明ＦＳＨ有益于卵母细胞生长过程中细胞质的成熟，单层培养的卵巢颗粒细胞对腔前卵泡的体外生长也具有促进作用，将体外受精后发育至２－细胞的胚胎     

小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究

小鼠腔前卵泡在体外生长过程中，于培养液中添加血清，以及ＦＳＨ和胰岛素均对小鼠腔前卵泡的体外生长、体外成熟、体外受精起促进作用，其中以胰岛素的效果最为显著，腔前卵泡的体外成熟率和体外受精率可达６９．４％和８０．６％，但是体外受精后的体外发育率低于添加ＦＳＨ的试验组，表明ＦＳＨ有益于卵母细胞生长过程中细胞质的成熟。单层培养的卵巢颗粒细胞对腔前卵泡的体外生长也具有促进作用。将体外受精后发育至２—细胞的胚胎移植入受体鼠，胚胎可以正常着床发育。同时，卵母细胞的核仁和线粒体在培养过程中也发生相应的变化。     

小鼠卵泡卵母细胞体外成熟培养基的选择

试验选用30只昆明小白鼠,采出卵巢回收卵泡卵母细胞,分别在培养基WM、TALP、M-199、mD-PBS和BMOC-3中培养。小鼠卵泡卵母细胞在五种培养基中的发育率都在81％以上,统计处理之间都没有显著差异。但成熟率差异明显,其中WM最高(65.7％),BMOC-3最低(18.2％),TALP、M-199和mD-PBS则相近,三者的成熟率分别为37.1％、37.5％和38.5％。试验资料表明WM是小鼠卵泡卵母细胞体外成熟的最佳培养基。     

猪体外成熟卵母细胞凋亡的形态观察

将猪成熟卵母细胞直接放入NCSU23培养液中培养,通过形态观察和Hoechst33342染色,并与孤雌激活卵子对照,探明猪体外成熟卵母细胞凋亡的规律.在未激活组中,胞质不均匀分裂是主要的趋势,高于坏死和胞质均匀分裂;胞质不均匀分裂在24 h出现,在24～96 h时间段有较大的增幅,最高胞质不均匀分裂率出现在132 h;胞质均匀分裂在12 h出现,在24～72 h时间段有较大的增幅,最高胞质均匀分裂率出现在120 h,之后略有下降;坏死在12 h出现并持续增加,在24～108 h增幅较大,180 h坏死率为28.6%.孤雌激活组中,胞质均匀分裂是主要趋势,但60 h后坏死率高于胞质不均匀分裂;胞质均匀分裂在12 h出现,在24～60 h时间段有较大的增幅,最高胞质均匀分裂率出现在60 h,并出现了5.6%的囊胚率;胞质不均匀分裂在24 h出现并持续增加,在24～72 h时间段有较大的增幅,180 h的胞质不均匀分裂率为15.4%;坏死在12 h出现,在24～108 h增幅较大,180 h之间的坏死率为39.6%.未激活组胞质不均匀分裂形态明显高于孤雌激活组,96h后差异显著(p《0.05);孤雌激活组胞质均匀分裂形态高于未激活组,60h后,两组差别显著(p《0.05);孤雌激活组坏死形态高于未激活组,96 h后两组出现明显差异(p《0.05).     

促减数分裂甾醇（MAS）对猪卵母细胞体外成熟及其胚胎发育能力的影响

利用促减数分裂甾醇(MAS)合成代谢过程中的抑制剂AY9944累积FF-MAS的原理,在猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944,间接地研究了内源性MAS对猪卵母细胞体外成熟质量的影响.猪卵丘卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)培养在NCSU23成熟培养液中,并添加不同浓度(0,10,20,40μmol/L)的AY9944培养44h.培养结束后,成熟的卵母细胞进行孤雌激活和以胎儿成纤维细胞为核供体重构胚胎,分别于48和144h观察胚胎发育情况,统计卵裂率和囊胚率及囊胚/2-细胞胚比率.结果如下:(1)随着AY9944添加浓度的增加,退化的卵母细胞增多,40μmol/L AY9944处理的退化卵显著,卵母细胞成熟率显著下降.(2)成熟培养液添加20和40μmol/L AY9944处理的孤雌激活胚胎的囊胚形成率和2-细胞胚发育到囊胚的比率显著增加(P<0.05).(3)以对照组(0μmol/L AY9944)和20μmol/L AY9944处理的卵母细胞为胞质受体,发现20μmol/L AY9944处理的克隆胚的发育能力囊胚率和2-细胞胚发育到囊胚的比率有所提高,但无显著差异(P>0.05).以上结果表明,猪卵母细胞体外成熟过程中添加AY9944提高了猪卵母细胞体外成熟的胞质质量,胚胎的发育能力提高.     

哺乳动物卵母细胞体外成熟培养的影响因素

随着哺乳动物体外受精、细胞核移植和外源基因导入等高新技术的不断深入，人们对成熟卵母细胞以及哺乳动物胚胎需求量日益增加，卵巢内丰富的卵泡资源是胚胎工程迅速发展的基础。通过卵巢卵母细胞体外成熟获取大量成熟卵母细胞，然后进行体外受精、体外生产胚胎愈来愈引起人们的注视。对影响卵母细胞体外成熟的因素进行了综述。     

猪体外成熟卵母细胞激活方法的比较

研究了离子霉素/6-二甲氨基嘌呤(DMAP),乙基汞硫代水杨酸钠/二硫苏糖醇(DTT)激活猪体外成熟卵母细胞的最佳条件,比较研究了电脉冲和化学刺激对猪体外成熟卵母细胞的激活效率.结果表明,用15μmol/L离子霉素处理猪体外成熟卵母细胞10,20,30,40,50,60和70min,其囊胚发育率差异不显著,以40min时的囊胚发育率最高.用15,20和25μmol/L离子霉素处理猪体外成熟卵母细胞,其囊胚率无显著差异.用100,200和300μmol/L乙基汞硫代水杨酸钠分别激活猪体外成熟卵子,发现100μmol/L乙基汞硫代水杨酸钠中处理30min组的卵裂率和囊胚率最高.电脉冲与两种最佳化学激活组的比较研究表明,电激活组的囊胚率最高,但囊胚细胞数低,相反,乙基汞硫代水杨酸钠/二硫苏糖醇激活组的囊胚细胞数最高,囊胚率却较低.     

花背蟾蜍卵母细胞体外成熟过程的细胞学研究

采用体外跌卵和石蜡切片的方法，对激素诱导下花背蟾蜍卵母细胞的体外成熟过程进行了细胞学研究．结果表明：花背蟾蜍卵母细胞与激素接触１５ｈ可达到生理上的成熟，即第二次成熟分裂中期．在此过程中，卵母细胞的核、质及卵膜均经历了一系列复杂的形态学变化，其中与激素接触１０～１２ｈ期间是卵母细胞形态发生变化最显著的时期     

生长因子对猪卵母细胞成熟及孤雌胚胎发育的影响

主要探讨了三种生长因子对猪卵母细胞成熟及孤雌胚胎发育及多能基因表达的影响,结果表明:成熟液中添加生长因子后可显著提高卵母细胞成熟率;成熟液和发育液中都添加生长因子后胚胎卵裂率、囊胚率及胚胎质量均显著升高;添加生长因子可极显著提高孤雌囊胚中多能基因的表达.本研究为提高猪卵母细胞成熟及胚胎早期发育奠定了基础,进而为获得更利于分离培养猪胚胎干细胞系的囊胚材料提供了参考.     

羔山羊卵泡的发育及卵母细胞体外成熟的研究

为利用羔羊作供胚羊，采用三种超数排卵的方法，对出生后４０～１５０日龄的羔山羊进行超数排卵处理以后，从活体采集卵巢卵母细胞在体外进行了培养．研究结果表明，采用超数排卵的技术能够诱导未性成熟羔山羊的卵巢卵泡的发育，由超排后采集到的羔山羊卵泡卵母细胞经体外培养有继续发育成熟的能力．适宜的超排方法为ＦＳＨ１０ｍｇ＋ＬＨ１．５ｍｇ（肌肉注射），羔山羊适宜的超排日龄为４０～９０ｄ，卵母细胞的体外适宜培养时间为１８～２８ｈ．     

犬卵母细胞体外成熟培养前后的超微结构变化

从屠宰场采集犬卵巢，收集间情期（不可见卵泡）和发情期卵巢卵母细胞。成熟培养前，其超微结构有以下特征：间情期犬卵母细胞与卵丘细胞间以及卵丘细胞之间通过胞质突起相连，胞质中的主要细胞器是线粒体和脂滴，质膜下有发达的粗面内质网；囊状卵泡的卵母细胞，结构近似于间情期犬卵母细胞，但细胞间连接更为普遍，胞质中细胞器更加丰富，并出现零星的皮质颗粒。经ＴＣＭ１９９＋２０％ＦＣＳ＋１０ＩＵ／ｍＬＦＳＨ体外培养３６ｈ后，微绒毛、线粒体、滑面内质网、皮质颗粒等细胞器增多，胞质内细胞器向皮质区迁移，核仁发生致密化。体外培养７２ｈ后，卵母细胞进一步成熟，表面微绒毛由倒伏状变得细长且坚起，皮质颗料沿质膜下呈线行排列，线粒体分散于皮质中央     

猪卵母细胞体外成熟培养时间及去核方法的研究

对不同体外成熟培养时间的猪卵母细胞进行盲吸法去核及利用脱羧秋水仙碱(DC)和放线菌酮(CHX)的化学诱导法去核效率进行了比较研究.用盲吸法去核,体外成熟培养(IVM)39~41 h组卵母细胞去核率与IVM 36~38 h组差异显著(P<0.05),与42~44 h组差异不明显(P>0.05),但3组显著高于IVM 45~48 h组(P<0.05).化学诱导法去核结果,IVM 42~44 h组去核率最高,但与IVM 39~41 h组差异不显著(P>0.05),其他各组间均差异显著(P<0.05).在相同的体外成熟培养时间内,盲吸法的去核率比化学诱导法的去核率要高.猪卵母细胞IVM在39~44 h内去核率较高,且盲吸法去核效率高于化学诱导去核.     

褪黑素对小鼠卵母细胞体外自发成熟的影响

本文通过卵母细胞自发成熟体外培养模型研究了褪黑素(MT)对小鼠如母细胞成熟的影响。结果表明:0.1mg/ml、0.02mg/ml、0.004mg/mg及0.0008mg/ml浓度的MT均能显著抑制小鼠卵丘卵母细胞复合体(CEO_s)自发成熟过程(P<0.01)。但对裸卵(DO_s)自发成熟,没有影响。结论:MT是调节哺乳动物卵母细胞成熟的重要激素之一,其作用机制可能是通过卵丘细胞实现的。     

温度对狗卵母细胞体外成熟培养的影响

以兰州土狗为实验动物,研究不同的温度对兰州土狗卵母细胞的体外成熟培养的影响,结果表明,采用不同温度以微滴(上覆灭菌矿物油)培养卵母细胞,其体外成熟率差异极显著.     

年龄、成熟方式及培养液对小鼠卵母细胞体外成熟和人工活化的影响

为研究卵母细胞能充分在体外成熟和发育,比较了年龄、成熟方式及培养液对昆明白小鼠卵母细胞体外成熟和人工活化的影响.1.5月龄、3月龄、6月龄、9月龄和12月龄小鼠的GV期卵母细胞其体外成熟率无差异(P0.05).经人工活化后,与体内成熟的卵母细胞相比,体外成熟的卵母细胞发育到原核期胚和2-细胞期胚的比率都明显降低;体外成熟的生长在HTF培养液的卵母细胞发育到2-细胞期胚的比率(44.4%)显著高于生长在M16培养液的比率(22.9%)(P0.01).结果表明昆明白小鼠卵母细胞的体外成熟不受年龄影响,体外成熟的卵母细胞人工活化后支持发育的能力比体内成熟的差,HTF培养液更适合小鼠卵母细胞人工活化后的进一步发育.     

猪卵母细胞体外成熟及电激活后发育能力的研究

探讨了不同的成熟培养液及外源激素对猪卵母细胞体外成熟培养及电激活后孤雌胚胎发育能力的影响. 结果表明：（1）改良M199（mM199）组猪卵母细胞成熟率显著高于M199组，且这两组又较NCSU-23组能极显著提高卵母细胞的成熟率. （2）孕马血清（PMSG）+人绒毛膜促性腺激素（hCG）+促卵泡素（FSH）组卵母细胞成熟率略高于FSH+促黄体素（LH）组，两者卵母细胞成熟率极显著高于尿促性腺激素（hMG）组. （3）含胎牛血清（FBS），猪卵泡液（PFF），表皮生长因子（EGF）的培养液较对照组在卵母细胞成熟率上无显著差异，但均能显著提高电激活后的卵裂率.添加EGF组桑囊率明显高于不添加组.但分别添加FBS和PFF组较对照组在桑囊率上均无显著差异. （4）卵丘细胞扩散与卵母细胞第一极体排出之间无直接相关性，但扩散程度好能提高电激活后的卵裂率.     

不同培养液对卵母细胞体外成熟及重组卵母细胞孤雌活化的影响

为研究生发泡(GV)移植后的重组卵母细胞能充分在体外成熟和发育,比较了几种培养液对GV期卵母细胞体外成熟和重组卵母细胞孤雌活化的影响.自然获得的GV期卵母细胞和经显微操作获得的重组卵母细胞在M2、HTF和M199培养液培养,其体外成熟率无差异(P&gt;0.05);但成熟的重组卵母细胞经人工活化后,生长在HTF培养液的细胞发育到2-细胞期胚的比率(49.2%)明显高于生长在M199培养液的比率(28.9%)(P&lt;0.05).结果表明HTF培养液更适合小鼠卵母细胞的体外成熟和进一步发育.     

季节对猪体外成熟卵母细胞的发育能力的影响

猪的卵母细胞对外界环境非常敏感,这造成猪的胚胎学相关研究是家畜繁殖学研究领域中最困难的方面之一.文章的研究目的是描述季节的变化对体外成熟卵母细胞发育能力的影响.研究中比较了不同季节每对卵巢获得A/B级卵的数量以及卵母细胞核成熟的比例(实验1),另外统计分析了不同季节孤雌(实验2)和核移植(实验3)胚胎发育能力的差异,最后在冬春两季分别进行了克隆胚胎的移植以观测其体内发育情况(实验4).结果显示实验1,春季(3月到5月)COCs/卵巢的比例最高(7.6±3.5),夏,秋,冬季的比例依次是(6.4±3.3),(6.7±2.9),(6.7±3.4),p<0.05.然而,没有发现卵母细胞的MⅡ比例有显著性差异((75.3±3.3)%,(73.5±2.3)%,(73.0±4.2)%,(76.5±6.7)%,依次是春,夏,秋,冬季的MⅡ比例,p<0.05).实验2,观察到夏季孤雌胚胎的囊胚率显著性降低(10.1±2.6)%,春,秋,冬季的孤雌胚胎囊胚率依次是(27.2±3.4)%,(22.4±3.5)%,(22.4±3.4)%,p<0.05.实验3,猪体细胞克隆胚胎在春季囊胚率获得提高((12.2±1.3)%,秋,冬季的克隆胚胎囊胚率依次是(10.2±1.2)%,(8.1±1.4)%,p<0.05).实验4,发现冬季胚胎移植无论是妊娠率还是出生率都明显低于春季.以上结果表明季节变化影响体外成熟卵母细胞的发育能力.     

EGF、IGF-Ⅰ对牛卵母细胞体外成熟的影响

在牛卵母细胞体外成熟培养液中添加不同量的EGF、IGF-Ⅰ,观察其对牛卵母细胞体外成熟的影响并确定成熟液中添加这两种生长因子的最佳浓度.在卵母细胞成熟培养液中分别添加1 ng/m l、10 ng/m l、50 ng/m l、100 ng/m l、200 ng/m l的EGF,10 ng/m l、50 ng/m l、100 ng/m l、150 ng/m l、200 ng/m l的IGF-Ⅰ,分析成熟培养22 h后的卵母细胞成熟率.发现添加有EGF实验组的成熟率分别是36.73%、42.18%、56.18%、53.67%、56.50%,同对照组相比都较对照组的成熟率(34.04%)高,且50 ng/m l、100 ng/m l、200 ng/m l实验组的成熟率同对照组差异显著(P<0.05).IGF-Ⅰ实验组的成熟率分别是38.46%、46.94%、58.73%、55.00%、58.70%,50 ng/m l、100 ng/m l、150 ng/m l、200 ng/m l都较对照组的成熟率(38.60%)要高,100 ng/m l、150 ng/m l、200 ng/m l实验组同对照组相比差异显著(P<0.05).将50 ng/m l的EGF、100 ng/m l的IGF-Ⅰ共同添加在成熟培养液中得到的成熟率为75.00%,同对照组(36.54%)相比差异极显著(P<0.01).在牛卵母细胞体外成熟培养液中添加EGF、IGF-Ⅰ会提高卵母细胞的成熟率,并且随着浓度的增加,这种作用将达到饱和,其最佳作用浓度为50ng/m l EGF、100 ng/m l IGF-Ⅰ.