不同降温速率对奶绵羊冻后精子质膜和线粒体膜完整性的影响

冻精的生产和应用可充分保存和利用优秀种畜的遗传资源并加快品种改良进程.然而,目前绵羊的冻精技术体系还不完善.戴瑞羊(DairyMeade)是国内引进的新型乳用绵羊品种,为建立适用于戴瑞羊的细管冻精生产方案,本研究选用3只18月龄的戴瑞种公羊(N1、N2、N3),在冷冻曲线的-10℃～-100℃危险温区内设置8个降温速率(30℃/min～100℃/min,间隔10℃/min),利用程序化冷冻仪生产细管冻精,并比较了冻后精子的质膜完整率、线粒体膜完整率和IVF后的胚胎卵裂率.结果显示:1)N1羊60℃/min、70℃/min和80℃/min三个降温速率下冻后精子质膜完整率无显著差异,但显著高于其他5个降温速率组(P0.05); N2与N3羊60℃/min降温速率下的冻后精子质膜完整率与80℃/min组差异不显著,但显著高于其他6个降温速率组(P0.05); 2)三只羊60℃/min降温速率下冻后精子的线粒体膜完整率与70℃/min降温速率组无显著差异,但显著高于其他6个降温速率组(P0.05); 3)60℃/min组冻后精子体外受精后的胚胎卵裂率最高.结果表明,在-10℃～-100℃降温区间内60℃/min的降温速率可获得质量较好的戴瑞羊细管冻精.本研究为戴瑞奶绵羊冻精程序的优化提供了理论依据.     

牛精液冷冻技术的研究进展

简要介绍精液冷冻技术发展历史,分析影响牛冷冻精液受胎率的主要技术因素。认为近年来冻精生产和应用的各个技术环节均没有重大突破,今后应该继续对这些环节进行优化组合,尤其是在水牛冻精生产技术的标准化、细管冻精生产成本的降低及分离精子的冷冻保存等方面应加大研究投入和力度。     

大黄鱼精子冷冻复苏后活力和超微结构的变化

大黄鱼精子以甘油为冷冻保存剂,经冷冻-解冻复苏后观察精子的活力和超微结构变化,并进行人工授精,观察冻精的受精能力.实验结果表明,冷冻精子的活力较高(83.1±6.2)%.大部分冷冻精子结构完整,进行人工授精可以获得较高的受精率(71.5±11.6)%.与鲜精对照组比较,仍存在差异(P<0.05).部分冷冻-解冻后的精子结构出现异常,畸形率达到29.3%(P<0.01).较常见的异常是精子质膜膨胀或破损,核膜消失,染色质解体,线粒体嵴消失,轴丝断裂成许多段等.冷冻精子结构异常可能是冻精解冻复苏后精子活力和受精力下降的主要原因.     

维生素E和丁基羟甲苯在绵羊精液深冻过程中对精子的保护作用

近年来,文献报道稀释液中添加维生素 E、丁基羟甲苯或其他抗氧化剂能提高绵羊深冻精液的受胎率。一些实验室就抗氧化剂对精子的作用进行了探讨。我国也有一些单位,将维生素 E 用于绵羊精液深冻技术,但效果都不明显。目前绵羊精液深冻技术尚待改进,探讨抗氧化剂对冻精的作用有一定的意义。因此,我们进行了维生素 E 和丁基羟甲苯对绵羊深冻精子作用的实验,主要测定了谷草转氨酶、透明质酸酶和顶体蛋白酶活性及冻前冻后精子的活力。同时还观察了抗氧化剂对精子中过氧化物生成量的影响。     

冷冻对萨能山羊精子超微结构影响的研究——冰冻蚀刻电子显微镜观察

用冰冻蚀刻电子显微镜法对4头萨能成年山羊的原精和冻精超微结构进行了初步观察。结果表明:冻伤首先从质膜开始,继而损伤顶体和线粒体。损伤方式主要表现为镶嵌在单位膜内的蛋白质微粒的分布、排列和形态的改变,以及微粒之间联结的变化。其次表现为局部的机械性损伤。山羊精子也和人类精子一样,头部表面存在三个典型的区域。本文对各区特征作了描述。此外观察到柠檬酸钠——脱脂乳——甘油比Tris——葡萄糖——甘油稀释液对精子的保护性能为优。     

生殖细胞及胚胎冻存技术发展及展望

生殖细胞及胚胎冷冻保存是生物种质资源保护及开发的重要技术,为人类自身健康医学发展、遗传育种、养殖生产和生物资源保护等提供重要支持。研究认为,针对不同物种及不同类型生殖细胞及胚胎的特点,冷冻保存技术具有较大差异。目前,生殖细胞及胚胎冷冻保存技术主要分为慢速冷冻和快速冷冻,对冷冻对象均具有较大程度损伤。而不同冷冻保护剂的运用可有效降低不同冷冻技术应用时对生殖细胞及胚胎的损伤作用。查找和优化冷冻方法类型及冷冻剂配方,是针对研究对象建立适合的冷冻技术的关键。本文以现有研究为依据,对动物精子、卵母细胞和胚胎的冻存方法进行梳理并展开综述,以期为相关研究及技术人员提供参考。     

辅助生殖技术中锌对精子的保护作用

目的:探讨辅助生殖技术中锌保护精子损伤的作用.方法:应用精子密度梯度离心的方法进行精子优选,优选的精子分为空白对照组、过氧化氢处理组和实验组,实验组受过氧化氢刺激同时加入锌,培养5h后比较3组精子的存活率、活力、精子质膜完整性及精子DNA碎片.结果:过氧化氢刺激后精子的存活率、活力差,精子质膜完整性破坏,大量精子DNA损伤,而锌能明显保护精子质量的作用.结论:在辅助生殖技术中锌可抑制精子损伤,从而提高精子质量的作用.     

运用计算机辅助分析检测超低温保存的真鲷(Pagrosomus major)精子的质量

采用电脑辅助分析(CASA)检测二甲基亚砜(DMSO)作为抗冻剂超低温保存的真鲷精子运动特征及总运动率与受精率、孵化率的关系.以12%-21%DMSO作为保护剂超低温保存2周的精子解冻激活10 s后,运动精子百分率与鲜精的没有显著的差异,而且超低温保存过程没有明显的改变其运动速度和运动方式.然而超低温保存却显著地降低了冻精运动持续的时间,激活后30 s冻精总运动率显著低于鲜精,激活后60 s降至(52.1±9.2)%.我们以标准化的最佳精卵比500∶1对超低温保存的精子进行人工授精实验,发现冻精总运动率与受精率(r=0.869)、孵化率(r=0.826)呈显著的正相关.实验结果显示CASA系统可以客观地检测超低温保存的真鲷精子质量,进一步证明了CASA在精子质量检测中简单、快速、准确的优点,因此该方法在鱼类精子超低温保存研究中具有广阔的应用前景.     

17β—雌二醇对冷冻精液授精绵羊繁殖率的影响

用冻精给绵羊授精,引起受胎率下降的一个重要原因,认为是精子运行中活力的下降。由于雌二醇能促进精子运行的启示,给孕酮诱导发情的成年母羊,注射17β—雌二醇,测定其用冷冻精液授精后的效果。据授精后18天所作的孕酮测定:注射17β—雌二醇,50毫克的母羊受胎率为43％;用冷冻精液人工授精而不注射雌二醇的母羊受胎率为52％;和新鲜精液人工授精的母羊为86％。产羔率分别为6,35和69％。对雌二醇处理的母羊来说,受胎率和产羔率之间有明显的差别,提示雌二醇事实上造成早期胚胎死亡的增加与使用冷冻精液有关。     

运用计算机辅助分析检测超低温保存的真鲷（Pagrosomus major）精子的质量

采用电脑辅助分析（CASA）检测二甲基亚砜(DMSO)作为抗冻剂超低温保存的真鲷精子运动特征及总运动率与受精率、孵化率的关系.以12%—21% DMSO作为保护剂超低温保存2周的精子解冻激活10s后，运动精子百分率与鲜精的没有显著的差异，而且超低温保存过程没有明显的改变其运动速度和运动方式.然而超低温保存却显著地降低了冻精运动持续的时间，激活后30s冻精总运动率显著低于鲜精，激活后60s降至（52.1±9.2）%.我们以标准化的最佳精卵比500∶1对超低温保存的精子进行人工授精实验，发现冻精总运动率与受精率（r=0.869）、孵化率（r=0.826）呈显著的正相关.实验结果显示CASA系统可以客观地检测超低温保存的真鲷精子质量，进一步证明了CASA在精子质量检测中简单、快速、准确的优点，因此该方法在鱼类精子超低温保存研究中具有广阔的应用前景.     

维生素B_(12)对牛冷冻精液精子质量的影响

牛精液冷冻前于精液稀释液中添加ＶＢ１２为试验组，不添加ＶＢ１２的为对照组。冷冻结果表明：试验组冻精解冻后精子活力、顶体完整率分别比对照组提高１６．１１％（Ｐ＜０．０１），１５．９％（Ｐ＜０．０１）；精子畸形率与ＧＯＴ活性均明显下降；精子存活时间延长。说明ＶＢ１２在牛精液冷冻中对牛精子形态结构具有保护作用。     

花生凝集素受体在中华绒螯蟹生精细胞的分布

以中华绒螯蟹为材料,应用凝集素印迹法检测中华绒螯蟹生精细胞中的花生凝集素受体.以凝集素组织化学技术为手段,采用生物素标记的花生凝集素对中华绒螯蟹精子发生过程中花生凝集素受体进行了标记,研究精子发生过程中花生凝集素受体的分布特征.结果表明,中华绒螯蟹生精细胞中的花生凝集素受体的分子质量为72 ku;精子发生过程中,不同的生精细胞膜有不同程度的阳性标记.精原细胞质膜上有较强的阳性标记,呈深棕色;精母细胞的质膜阳性标记减少;精细胞与精母细胞染色程度相似.PNA受体在生精细胞中分布,可能与生殖细胞发育以及生殖细胞之间或者生殖细胞与体细胞之间的信息传递有关.精子质膜、顶体区域也有阳性标记,这可能与精卵识别及结合等受精过程息息相关.     

冷冻保存对精子运动的影响

目的：观察精子运动状态,其中包括精子折断现象与冷冻损伤的关系。方法：对精液标本进行一步冷冻保存和分步冷冻保存,并用鉴别精子形态湿片法对冷冻前后精子运动状态及折断率进行评价。结果：冷冻保存复温后的精子活动率与冷冻前的精了活动率比较明显下降（P＜0．01）;含冷冻保护剂的实验组与不含冷冻保护剂的对照组比较,精子率呈显著性差异（P＜0．01）,精子折断率无显著性差异（P＞0．05）;一步冷冻和分步冷冻保存的精子之间活动率及折断率相比较,无显著性差异（P＞0．05）。结论：冷冻保存易造成精子活动率下降、运动形态异常,但不能显著地导致精子折断发生率增加。     

不同冷冻方法和解冻液对猪精液冷冻效率的影响

采用三种不同的冷冻方法冷冻猪的新鲜精液,再分别用不同的解冻液在相同条件下同时解冻,对比解冻后精子的活力和顶体完整率,以优化猪精液冷冻方法.实验一:随机选取三头健康的有稳定受精能力的优良种公猪,采集新鲜精液,分别用干冰颗粒、液氮颗粒和液氮细管三种方法冷冻,用同样的方法解冻,对比解冻后精子的活力和顶体完整率;实验二:用不同的解冻液解冻经干冰颗粒法冷冻的精液,对比不同解冻液对精子活力的影响;实验三:以孤雌激活和鲜精受精为对照,验证经实验一和实验二选择出来的最优冷冻方法和解冻液处理后的精子的体外受精能力.实验一显示,干冰颗粒冷冻法冷冻的猪精液解冻后精子活力(0.23)略高于液氮颗粒法的精子活力(0.20),而二者均显著高于细管冻精法的精子活力(0.08)(P<0.05),液氮颗粒法的顶体完整率(54.7%)和细管法的顶体完整率(54.2%)无显著差异,但二者均显著低于干冰颗粒法的顶体完整率(58.0%)(P<0.05).实验二显示,Glucose-EDTA解冻液解冻后,精子活力(0.22)显著高于DPBS-BSA解冻液解冻后的精子活力(0.13)(P<0.05).实验三:经干冰颗粒法冷冻、Glucose-EDTA解冻液解冻的精液,体外受精后的囊胚发育率(17.6%)与鲜精体外受精囊胚率(17.9%)无显著差异,但二者均显著低于孤雌激活对照组的囊胚率(36.6%)(P<0.05).由此可知:干冰颗粒法冷冻结合Glucose-EDTA解冻液解冻是较为理想猪精液冷冻保存方法,经该方法冷冻、解冻的猪精液,体外受精后的胚胎发育率与鲜精没有显著差异.     

OEP、SDS与卵黄的相互作用时间及温度对犬冻融精子质量的影响

人工采取8只优质犬精液,以果糖-Tris-柠檬酸所组成的稀释液为基础,分别于试验前0.5 h和24 h将OEP,SDS和卵黄混合于基础稀释液中,并于5℃冰箱、22℃两个温度条件下保存,用时离心选取上清液作为稀释剂并制成细管冻精.利用流式细胞术和高倍显微镜对犬冻融精子活力、质膜完整率和顶体完整率等特性进行测定,目的在于比较不同温度条件下OEP,SDS和卵黄相互作用时间的长短对犬冻融精子质量的影响,以探讨OEP,SDS对冻融精子的保护作用机理.添加稀释液前24 h混合OEP和卵黄有利于维持冻融过程中质膜完整率(61.5%)和顶体完整率(66.8%),显著提高冻融精子的总活性比率(20.2%),对犬冻融精子的保护效果明显好于相互作用0.5 h实验组的保护效果(P<0.05);OEP,SDS与卵黄相互作用时的温度对犬冻融精子质量无显著影响(P>0.05),OEP对犬冻融精子的保护效果明显优于SDS.结果提示增加OEP,SDS与卵黄相互作用的时间可以提高犬冻融精子的质量.     

超低温保存存前后太平洋牡蛎精子（Crassostrea gigas（Thunberg）超微结构观察

应用扫描电镜和透射电镜技术，研究超低温冷冻前后太平洋牡蛎精子形态与超微结构。结果发现，受伤精子被膜肿胀、皱褶、破裂；顶体变形、囊泡化、顶体膜肿胀，局部断裂；核膜肿胀，破裂，核空泡化；线粒体嵴变形、消失，基质电子密度降低，结构模糊；精子鞭毛被膜膨胀，鞭毛自精子基部或主、末段断裂。结果表明，超低浊冷冻和升温解冻，对牡蛎精子的膜结构损伤严重，导致精子活力和受精能力下降。     

关中驴精子超微结构的观察

利用电子显微超薄切片技术,对关中驴的精子在室温和冷冻保存下的超微结构做了观察,同时还以关中马的精液作了对比。统计分析表明,精子顶体完整率的差异,驴和马的鲜精之间不显著(P>0.05);驴的鲜精和室温保存第2、8、20个小时之间,差异亦不显著(P>0.05),而和保存32、44个小时之间差异显著(P<0.05);冻精和鲜精之间差异十分显著(P<0.001)。室温保存下精子活率的下降与线粒体完整率之间呈相关现象,而冻精无此现象。     

动物精子发生及成熟过程中凝集素受体的分布与变化

对各种动物精子发生与成熟过程中生精细胞表面凝集素受体的变化做了综述 .精子发生过程伴随着不同凝集素受体的出现和变化 ,这些受体是由生精细胞自身合成的 ;精子在成熟过程中 ,质膜凝集素受体的合成、修饰及分布会进一步发生变化 ,这些变化与精子获得与卵子进行识别、粘附、结合等受精能力密切相关 .     

冷冻保存对人类附睾精子功能的影响

目的：了解人类附睾精子经历冷冻保存后的精子功能变化。方法：应用精子功能检测方法。结果：１１ 例先天性双侧输精管缺如患者附睾精子标本冷冻保存后,每例冷冻标本均见活动精子,但精子活动率显著降低,精子活动能力减弱。精子膜完整率显著下降,头膜损伤－ 尾膜完整的精子率（ Ⅲ型精子） 显著升高,精子体外存活时间显著缩短。精子顶体蛋白酶活性降低。去透明带地鼠卵穿透试验检验精子体外授精能力失败的标本,采用显微注射技术可使精子辅助授精。结论：（１） 冷冻保存对附睾精子功能有显著的影响,造成精子功能减弱;（２） 冷冻精子仅用单一尾膜肿胀试验筛选,有可能拾取到的是尾膜完整,但头膜损伤的精子;（３） 建立显微授精技术可有效地对冷冻附睾精子辅助受精。     

牛精子体外获能后的超微结构变化

用肝素 咖啡因作获能剂对牛冷冻 解冻精子进行体外获能处理 ,体外培养 1h ,在透射电镜下观察精子获能后的超微结构变化。结果表明 :(1)牛精子顶体内膜和外膜均为双层膜结构 ;(2 )精子获能后顶体囊泡化的形成有多种形式 :质膜与顶体外膜融合 ,双层顶体外膜自身融合 ,顶体外膜内陷或外突打褶 ,双层顶体内膜自身融合 ,顶体内膜外突打褶形成囊泡 ;而且在同一精子的顶体反应中可同时出现多种囊泡化形式 ;(3)精子获能后 ,头部无顶体覆盖的核后区核膜膨胀 ,并与膨胀的质膜融在一起 ;(4 )精子获能后 ,尾部质膜膨胀 ,且主段质膜比中段质膜膨胀明显 ,这可能与超激活运动有关。