P53信号通路的余维一分岔分析

细胞中的DNA受损后,肿瘤抑制蛋白p53表现出丰富的动力学,并在决定细胞命运中起到关键的作用.基于PDCD5调控p53-Mdm2振子模型,增加了ATM感应模块,并探讨了在不同PDCD5表达水平下,ATM二聚体转为单体的速率对p53动力学的影响.通过余维一分岔分析,可以看出在不同速率下,p53表现出丰富的动力学,包括单稳态、双稳态、三稳态、振荡以及振荡与单稳态共存.通过对p53动力学的研究,对理解DNA损伤后的细胞命运起到一定的指导作用.     

PDCD5调控的p53动力学分岔分析

肿瘤抑制蛋白p53在DNA损伤的反应中起到关键的作用.基于PDCD5(Programmed Cell Death 5)调控的p53-Mdm2振子模型,增加了药物依托泊苷(etoposide,简称ETS)引起DNA损伤进而激活ATM(ataxia telangiectasia mutated)的模块.通过分岔分析,首先探讨了PDCD5和ETS剂量调控的p53动力学.在任何ETS剂量下,随着PDCD5浓度的增加产生了超临界Hopf分岔,系统由单稳态转为振荡.其次,在确定的ETS剂量下,讨论了PDCD5和激活的ATM降解速率对p53动力学的影响.随着这两个参数的变化,p53展现出丰富的动力学,包括单稳态、两个稳定的稳态、振荡以及单稳态与振荡共存的双稳态.通过研究这些参数对p53动力学的影响,可以在理解DNA损伤后的p53信号通路调控中起到一定的指导作用.     

具有时滞的P53调控网络的动力学分析

肿瘤抑制蛋白P53的动力学在细胞受到压力后对细胞命运起到重要作用.P53动力学与DNA损伤强度和P53信号通路中蛋白质表达水平密切相关.最近的研究考虑了蛋白质PDCD5调控P53信号通路并分析了对P53动力学的影响,却忽略了通路中基因转录和mRNA翻译时滞的作用.在本文,针对PDCD5调控具有时滞的P53信号通路模型,...     

p53振子的形成机制及microRNA对p53目标基因表达的精细调控

肿瘤抑制因子p53调控着大量的基因,在肿瘤抑制中起着关键作用.实验结果表明,当DNA受损后,p53的表达呈现周期性振荡.已有的一些p53振子的理论模型,其振子产生机制通常依赖于p53和Mdm2之间相互作用的时滞因素.考虑基因表达的转录和翻译过程,运用动力学方程建模的方法,给出一种新模型,并利用Hopf分叉理论,给出p53振子产生的条件.数值模拟结果表明,与已有的时滞模型相比,该模型对参数具有更好的鲁棒性,较好地解释了p53振子的产生机制.最近的许多实验表明,p53调控着miR-34家族中大量microRNA的表达,这些microRNA又在后转录水平上对p53的下游目标基因起着调控作用.在这一模型基础上,研究microRNA加入p53调控网络后所起的调控作用,数值模拟结果初步表明,microRNA对p53下游目标基因表达起到了精细调控作用.     

p53/p21通路对氧糖剥夺复氧诱导肝细胞死亡的保护作用

缺血再灌注损伤参与了各种病理生理过程.在肝脏中,由手术导致的缺血再灌注损伤可导致肝脏功能衰竭.以前的研究发现,周期蛋白依赖的抑制蛋白p21在缺血再灌注损伤中起保护器官的作用.为研究其作用机制,用肝细胞氧糖剥夺复氧(oxygen glucose deprivation and re-oxygenation, OGD/R)模型,对p53/p21通路在肝脏缺血再灌注损伤的机制作用进行探讨.结果表明,在OGD/R处理后,表达p53野生型的HepG2细胞的死亡率和活性氧(ROS)水平均显著低于p53缺失型的Hep3B细胞.在HepG2细胞中,RNAi沉默p53基因促进ROS水平和死亡率升高.抗氧化剂维生素E显著降低HepG2细胞的死亡率和ROS.进一步研究发现,p53通过上调其靶基因p21表达,抑制ROS产生,降低HepG2细胞死亡.因此,p53/p21通路在肝脏缺血再灌注损伤的保护作用可能与抑制ROS产生有关.     

抑癌因子p14-ARF对p53-MDM2网络的影响

p53是一种重要的抑癌因子，可激活细胞周期阻滞、DNA损伤修复、衰老或凋亡，在细胞命运决定中起重要作用。用ATMp的表达水平代表DNA损伤强度，建立了由p14-ARF调控的p53-MDM2网络的数学模型。通过数值模拟，分析了ATMp和p14-ARF对p53-MDM2通路的影响。研究表明，较低的ATMp水平会使p53p稳定在低稳态，适当的ATMp会激活p53-MDM2网络的振荡。此外，p53p的表达水平随着p14-ARF表达水平的升高呈现出低稳态，振荡和高稳态的动力学。     

筛选p53靶向药物的细胞模型的构建

为了筛选可以恢复肿瘤细胞中p53功能的小分子,作者用表达野生型p53的人类直肠癌细胞HCT116建立了一株能够应答激活p53信号通路的荧光素酶报告基因的稳定细胞系,同时用表达野生型p53的人类骨肉瘤细胞U2-OS建立了一株能够应答激活p53信号通路的mCherry红色荧光蛋白报告基因的稳定细胞系.为了检测筛选p53靶向药物的有效性,利用三种已知的以p53为靶点的小分子药物(cisplatin,doxorubicin以及Nutlin-3)处理这两种稳定细胞系,结果显示p53信号通路在这两个稳定细胞系中均能够被激活.为了探索小分子RNA作为恢复p53功能的靶标药物,并进一步验证这两种细胞模型用于药物筛选的可行性,分别检测了MDM2和MDMX的5个不同shRNA.通过比较HCT116稳定细胞的荧光素酶活性和U2-OS稳定细胞中荧光蛋白的荧光强度,我们筛选出了有效沉默MDM2或MDMX的shRNA.数据表明,这两种细胞模型不仅可用作筛选激活p53的小分子化合物的平台,而且可用于筛选激活p53信号通路的小分子RNA.     

Wip1对p53-Mdm2动力学的影响以及动力学分析

提出了p53-Mdm2和ATMp-p53-Wip1两条负反馈回路调控p53信号网络的数学模型,通过研究发现p53-Mdm2反馈回路对于p53脉冲的产生有一定的影响,与以往的研究吻合,更重要的是ATMp-p53-Wip1回路对p53脉冲也有着重要的影响.Wip1蛋白将会抑制ATM的磷酸化,从而减弱ATMp对p53的激活作用,但值得注意的是与Mdm2不同,Wip1虽然对p53脉冲有着重要的调控作用,但当Wip1浓度大于某一数值时,Wip1浓度的增加并不改变p53脉冲的振幅和周期.并且当p53-Mdm2和ATMp-p53-Wip1两条回路共存时,Wip1和Mdm2共同调节p53脉冲.     

MdmX在Axin-p53信号通路中的调控机制

鼠双微体基因X(MdmX)是肿瘤抑制因子p53信号通路中重要的负调控蛋白,它能与p53直接结合,抑制p53的转录活性.体轴发育抑制因子Axin作为构架蛋白与p53及同源结构域互作蛋白激酶2(HIPK2)等相互作用形成复合物,诱导p53的转录活化,共同促进细胞的凋亡.本研究将MdmX引入Axin-p53信号通路的调控中,发现MdmX通过竞争Axin与p53的结合,抑制Axin诱导p53的转录激活.p53结合区域缺失的MdmX突变体MdmXΔp53则不能抑制Axin对p53的激活.这些实验结果为进一步深入研究Axin-p53信号通路在细胞凋亡及肿瘤发生发展中的作用提供了重要的理论依据.     

pGL3-4×PRE-E4-luc报告基因质粒的构建及在p44信号通路中的应用鉴定

p53基因是一种重要的抑癌基因,其产物能够与靶DNA特异性结合并激活转录参与诱导细胞凋亡,调控细胞周期,控制细胞的增殖与分化.p44蛋白主要定位于前列腺癌细胞的细胞质,促进癌细胞的增殖.通过shRNA沉默p44的表达后,LNCaP细胞的生长受抑制, p53靶基因TIGAR和GLIPR1的表达增加.为探寻p53是否介导p44对TIGAR和GLIPR1的作用,本研究构建了pGL3-4×PRE-E4-luc报告基因质粒,并将其分别转染经NT-shRNA慢病毒和p44-shRNA慢病毒感染的LNCaP细胞,比较两者荧光素酶活性.结果显示,重组质粒pGL3-4×PRE-E4-luc构建成功,为进一步研究p53在肿瘤发生发展过程中的作用通路提供了新的手段.但LNCaP细胞中p44并非通过p53作用于TIGAR和GLIPR1基因,具体机制仍有待进一步研究.     

CTCF通过抑制p53信号通路促进胆管癌细胞的生长、迁移和侵袭

为了探索CCCTC结合因子(CCCTC-binding factor, CTCF)对人胆管癌细胞的生长、迁移和侵袭能力的影响及其潜在的分子作用机制,利用慢病毒感染法获得稳定过表达或敲低CTCF的胆管癌细胞系,采用蛋白质免疫印迹法(Western blotting, Wb)检测CTCF蛋白表达水平,采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法和克隆形成实验检测细胞生长情况,采用Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭能力,采用GraphPad软件(v6)的Mann-Whitney U检验分析CTCF基因在癌和癌旁组织间的mRNA差异表达.结果显示:过表达CTCF可显著促进HCCC-9810和RBE胆管癌细胞的生长、迁移和侵袭能力;敲低CTCF呈现相反的表型.通过通路富集分析发现:CTCF的表达水平在胆管癌中与p53信号通路活性显著负相关,过表达CTCF可显著下调p53及其靶基因p21的mRNA和蛋白表达水平,而敲低CTCF则显著促进p53和p21的mRNA和蛋白表达水平.综上,本研究揭示CTCF可能通过抑制p53信号通路而促进胆管癌细胞生长、迁移和侵袭而发挥促癌基因的功能.     

肿瘤抑制因子p53蛋白在毕赤酵母中的克隆表达

TP53基因在调控细胞信号通路和抑制肿瘤细胞中发挥着重要作用.本研究利用毕赤酵母表达系统以获得大量重组p53蛋白,为此,本文将人TP53基因克隆至表达载体p PIC3.5K,电转化进入毕赤酵母GS115,通过组氨酸筛选和G418筛选,获得高拷贝稳定转化子.SDS-PAGE和Western Blot检测结果表明p53蛋白可以在毕赤酵母中表达.本研究所获酵母菌株为今后大规模生产重组p53蛋白奠定了基础.     

神经生长因子125I偶联物诱导人胶质瘤U251细胞G2期阻滞

 观察¹²⁵I-NGF(神经生长因子)对U251细胞DNA的损伤作用,探讨¹²⁵I-NGF的抗肿瘤作用机制。应用微核测试和单细胞电泳等方法观察U251细胞DNA的变化,Western Blotting法检测细胞蛋白水平的变化,RT-PCR法检测Cyclin B1 mRNA水平的变化,微核测试和单细胞电泳等方法观察到¹²⁵I-NGF对U251细胞DNA的损伤作用。细胞周期检测及MPM-2/PI复染实验表明¹²⁵I-NGF诱导了U251细胞G₂期阻滞。Western Blotting检测表明,¹²⁵I-NGF可能通过活化ATM和ATR途径发挥抗肿瘤作用。¹²⁵I-NGF以剂量依赖性的模式减少了U251细胞Cyclin B1蛋白表达水平,但没有改变其mRNA的表达水平。在U251细胞中,磷酸化Chk1、Chk2和Cdc25c蛋白水平提高,而p53和p21水平保持不变。阐明了¹²⁵I-NGF通过对U251细胞DNA的损伤作用活化ATM和ATR通路,使多种蛋白的表达水平发生了改变,从而发挥其抗肿瘤的作用。     

p38-p53-p21信号通路参与调控血管紧张素-Ⅱ诱导的人血管平滑肌细胞衰老

血管紧张素-Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)是一个重要的血管活性肠肽,对血管的结构和功能有重要的调控作用.研究显示,伴随机体代谢形成的AngⅡ激活后在体内外均可诱导血管平滑肌细胞发生衰老.但AngⅡ究竟通过哪条信号通路引起人血管平滑肌细胞衰老,衰老的细胞在RNA和蛋白质层面上到底发生了哪些改变,仍不清楚.为此,本研究通过转录组测序(RNA-seq),结合实时定量PCR(qPCR)以及Western blot等方法研究AngⅡ诱导人血管平滑肌细胞衰老中的基因表达谱改变及参与的信号通路,发现参与其他细胞衰老的TGF-β信号通路在AngⅡ诱导的人血管平滑肌细胞衰老中受损.研究进一步发现p38-p53-p21信号通路参与调控人血管平滑肌细胞的诱导衰老过程;而p38-p16信号通路则不参与此衰老调控.本研究也提供了证据支持p53的调控也发生在磷酸化水平上.     

CD11b调控LPS刺激下巨噬细胞表达IL-12的分子机制

CD11b是白细胞整合素家族成员之一,在炎症的发生和发展中发挥重要作用.在内毒素血症小鼠模型,发现脂多糖(LPS)导致外周血白细胞介素12(IL-12)水平降低,而CD11b抑制剂能防止此现象发生.为阐明CD11b调控LPS刺激下IL-12产生的分子机制,本文利用RAW264.7细胞开展了进一步研究.酶联免疫吸附、实时定量PCR和Western Blot等检测结果表明,CD11b可抑制LPS刺激下RAW264.7细胞IL-12的表达;利用sh RNA敲低CD11b的表达则能提高LPS刺激下RAW264.7细胞IL-12p35、IL-12p40的转录水平和蛋白水平的表达;JNK和NF-κB信号通路与CD11b调控IL-12的产生关系密切,而p38、ERK信号通路影响较小.因此,研究结果提示,CD11b通过JNK和NF-κB信号通路抑制LPS刺激下巨噬细胞IL-12的产生,抑制CD11b的功能可能有助于削弱LPS引起的炎症反应.     

Delayed SubHopf-Fold/Fold Cycle簇发振荡及其动力学转迁

基于周期激励下的van der Pol-Duffing振子,研究了一类由Hopf分岔滞后引起的delayed sub Hopf-fold/fold cycle簇发振荡及其动力学转迁,这种簇发模式表现出余维-2簇发振荡特性。将周期激励看做慢变量,得到了快子系统和慢子系统。然后对快子系统进行分岔分析,给出了Hopf分岔和fold分岔的临界条件。最后利用分岔图和转换相图的叠加分析了该簇发振荡的产生机制及其动力学转迁。     

PDGFRA调控p53信号通路介导卵巢癌细胞增殖、凋亡和侵袭的作用及机制

为了探究血小板源性生长因子受体α(platelet derived growth factor receptor α,PDGFRA)调控卵巢癌细胞的增殖、凋亡和侵袭的作用以及具体机制，首先基于GEO数据库中相关基因芯片（GSE4122和GSE14407）分析验证PDGFRA在卵巢癌中存在的表达差异，再应用SangerBox在线分析PDGFRA与卵巢癌患者预后的关联性.构建PDGFRA过表达质粒，用MTT检测PDGFRA对OVCAR3细胞增殖的影响，用流式细胞术检测PDGFRA对OVCAR3细胞凋亡的影响，用Transwell检测PDGFRA对OVCAR3细胞侵袭能力的影响，用Western blot法检测p-p53、p53及p21蛋白的表达水平.结果发现：PDGFRA在卵巢癌中显著上调，与PDGFRA低表达患者相比，PDGFRA高表达患者的预后更差；与vector-NC相比，PAGFRA组细胞的增殖和侵袭显著提高，细胞凋亡及p-p53、p21蛋白的表达水平均显著下降.由此得出，PDGFRA通过介导p53信号通路调控影响OVCAR3细胞的增殖、凋亡和侵袭.     

Killin介导p53信号通路的机理与其在细胞周期不同时期特异性分布的相关性研究

本研究中,通过检测killin在其它p53下游相关基因缺失的情况下能否激活细胞凋亡,证明了p53通过killin介导的S期抑制以及细胞凋亡与p21、puma和bax通路没有直接关系.另外通过将EGFP-PCNA和RFP-killin表达质粒共同转染到cosE5细胞中,并观察细胞处于不同时期时Killin蛋白的分布情况,发现在细胞S期中Killin与PCNA的核定位呈现相互排斥的点状分布,与先前BrdU标记结果吻合.这一结果再次印证了Killin在S期可能抑制DNA复制.同时Killin被观察到在非S期时聚集于核仁内,从而可能影响核糖体RNA的合成.这些发现意味着killin作为主要的p53靶基因之一,可能在细胞周期不同检查点进行调控.     

p53对STK11的转录调控研究

PJ综合征(Peutz-Jeghers syndrome)是一种常染色体显性遗传疾病.其致病基因所编码的蛋白质为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STK11).STK11可以激活AMPK,p53等多条信号通路.文中在克隆了STK11的基本启动子区域基础上,用生物信息学分析预测该区域内可能存在p53结合位点和Sp1结合位点.EMSA结果证实了信息学分析的预测.Sp1结合位点核心碱基定点突变后,其PGL3重组突变体质粒萤光素酶活性下降1.9倍;p53结合位点核心碱基的定点突变后,PGL3重组突变体质粒萤光素酶活性下降14.6倍,均有统计学意义.利用内源表达STK11的L02细胞株,瞬时转染pcDNA3.1-myc-his-B(-)-p53,经Real-time PCR和Western blotting检测发现,p53过表达可以上调STK11的表达,因此p53对STK11的表达有正反馈调节放大作用.     

人P53的原核表达及包涵体复性研究

通过检测血清中p53蛋白及其抗体变化诊断肿瘤的ELISA试剂盒的研发需要大量制备p53蛋白.本研究通过构建人野生型p53基因的原核表达质粒pET-32a-p53,在大肠杆菌中诱导表达得到p53包涵体蛋白,经包涵体变性、亲和纯化、复性得到可溶p53蛋白.发现利用8M尿素对包涵体进行变性溶解,经镍柱亲和纯化得到纯度超过95%的变性蛋白.尝试透析复性、稀释复性和柱上复性3种方法分别对p53变性蛋白进行复性.结果表明透析复性的复性率最高,这为原核表达制备p53提供了一种参考.本研究为ELISA法检测血清中p53蛋白及其抗体诊断肿瘤相关试剂盒研发奠定了基础.