通过杂交亲和性评估外源抗除草剂基因在十字花科植物间的流动

十字花科许多植物表现为异花授粉和较高的种间杂交亲和性, 这些生殖特征喻示着外源基因在该科植物间存在潜在的流动风险. 通过苯胺蓝荧光法观察、人工杂交、混合花粉蒙导授粉结合杂交后代的分子鉴定, 研究了甘蓝型抗草甘膦油菜Q3与5种十字花科植物(共6个材料)的杂交亲和性, 以评估外源抗除草剂基因在上述植物间的流动. 结果表明, 甘蓝型油菜2个品种、雪里蕻、小白菜与Q3杂交的亲和指数分别为16.15, 12.77, 2.345和0.85, F₁代植株PCR检测为阳性; 诸葛菜、播娘蒿×Q3表现出高度不亲和, 荧光显微镜观察发现花粉管生长受阻, 分别停滞在诸葛菜花柱上部1/3处与播娘蒿柱头表面, 蒙导后代植株PCR检测均表现阴性. 在大田邻近间隔种植和自然授粉条件下, Q3与甘蓝型油菜2个品种、雪里蕻、小白菜间的基因流频率分别为2.3278%, 2.1487%, 1.0157%和0.9236%, 与诸葛菜、播娘蒿2种杂草的频率为0. 基因流频率与杂交亲和性高度相关. 本研究结果同时说明十字花科植物间的外源基因流动不容忽视.     

转基因玉米花粉引起的环境生物安全忧虑

一场由蝴蝶引起的风波 1999年5月．美国康奈尔大学罗西（J．E．Losey）等学者在《自然》（Nature）杂志上发表了一篇题为“转基因花粉伤害了君王斑蝶幼虫”（Transgenic Pollen Harms Monarch Larvae）的论文。该文犹如一石激起千层浪．迅速在全世界引起巨大反响。这篇不到一页的论文大致讲述了这样一个故事：抗虫转基因（Bt）可产生杀除鳞翅目害虫的蛋白质。Bt转基因玉米可在不施用化学杀虫剂的情况下防治玉米螟虫。     

兔防御素NP-1基因在转基因烟草中的表达及其对烟草青枯病的抗性研究

从兔子肝脏细胞中扩增到防御素ＮＰ－１成熟的编码序列,长约２００ｂｐ。将此片段插入到切除了ＧＵＳ编码序列的ｐＢＩ１２１质粒载体中,构建成植物表达载体ＰＢＩＣ－３５ＳＮＰ１。     

cp基因的修饰引起转基因的沉默及其介导的PVX抗性

将马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)外壳蛋白(coat protein, CP)基因(cp)编码序列中植物偏爱密码子替换成稀有同义密码子, 并将此修饰的外壳蛋白基因(cpm)及未修饰外壳蛋白基因(cp)分别置于CaMV 35S启动子后, 构建植物表达载体, 并用农杆菌介导转化烟草.Northern杂交及Run on实验结果表明, 转cpm基因烟草比转cp基因烟草发生转录后基因沉默(PTGS)的频率明显增高(从6.25%增至35%), 并且对人工接种的PVX病毒抗性显著提高.以上结果表明, 基因中密码子的替换可以明显提高转基因植株的病毒抗性.     

双价、三价种子特异性表达载体的构建及表达PHB合成相关基因的转基因油菜的获得

分离了种子特异性启动子和质体导肽序列,利用已经克隆的合成聚羟基丁酸酯的３个关键酶基因,分别构建了含有种子特异性启动子的嵌合ｐｈｂＣ（编码ＰＨＢ合酶）、ｐｈｂＢ（编码依赖ＮＡＤＰＨ的乙酰－ＣｏＡ还原酶）的二价及嵌合ＰｈｂＣ、ｐｈｂＡ（编码３－酮硫裂解酶）、ｐｈｂＢ的三价表达载体,并由导肽将基因表达产物定位于质体．经根瘤农杆菌介导获得转基因油菜,并进行了ＰＣＲ,Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ及ＲＴ－ＰＣＲ－ＤＮＡ杂交等分子检测．     

cp基因的修饰引起转基因的沉默及其介导的PVX抗性

将马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)外壳蛋白(coat protein, CP)基因(cp)编码序列中植物偏爱密码子替换成稀有同义密码子, 并将此修饰的外壳蛋白基因(cpm)及未修饰外壳蛋白基因(cp)分别置于CaMV 35S启动子后, 构建植物表达载体, 并用农杆菌介导转化烟草. Northern杂交及Run on实验结果表明, 转cpm)基因烟草比转cp基因烟草发生转录后基因沉默(PTGS)的频率明显增高(从6.25%增至35%), 并且对人工接种的PVX病毒抗性显著提高. 以上结果表明, 基因中密码子的替换可以明显提高转基因植株的病毒抗性.     

黑胫病弱毒种和化学诱导剂诱导油菜对黑胫病抗性的比较研究

油菜黑胫病是由弱毒种Leptosphaeria biglobosa和强毒种L. maculans混合感染引起的油菜严重病害. 本文比较研究了弱毒种预接种、化学诱导剂水杨酸类似物(acibenzolar-S-methyl)和维他命K₃类似物(menadione sodium bisulphite)处理所诱导的油菜对强毒种在抗性表型、组织细胞和RNA水平上的反应. 诱导接种或化学处理后用强毒种接种. 强毒种接种后8~21 d, 受诱导的植株其病斑扩展速度比水处理的对照显著降低, 无论是受诱导的叶(局部效应)还是上部未诱导的叶(系统效应)均如此. 强毒种接种后96 h, 观察到侵入叶组织的病原菌菌丝周围坏死的叶肉细胞, 而在对照的植株上没有观测到. 定量PCR分析表明, 病害防御反应的标记基因PDF1.2, PR-1, NPR1, APX和CHB4在接种后0~96 h的表达发生了变化. 弱毒种预接种处理优先激活了茉莉酸/乙烯途径的基因表达, 包括NPR1的诱导加强表达, 这种效应不仅是局部的, 而且是系统的.     

转烟酰胺合酶基因甘蓝型油菜盐碱胁迫下叶片蛋白质差异的研究

盐胁迫是危害农作物的主要非生物胁迫之一. 为了能从蛋白质水平揭示盐胁迫下油菜耐盐的分子遗传机制, 采用IEF/SDS-PAGE 双向凝胶电泳技术对转OsNAS1 基因的甘蓝型油菜在碱性盐胁迫下(20 mmol/L Na₂CO₃)的幼叶蛋白进行了分离. 通过银染显色, 获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱, PDQuest 软件在分子量20~75 kD, 等电点4~7 范围内,发现表达量变化2 倍以上的点有12 个. 对这12 个蛋白质点采用MALDI-TOF-MS 进行肽质谱指纹图分析, 有11 个蛋白点得到了可靠的鉴定, 其中有5 个差异蛋白可能与耐盐性有关,分别是二氢硫辛酸脱氢酶、谷胱甘肽-S-转移酶、过氧化物酶、20S 蛋白酶体?亚基以及核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶, 它们参与了物质能量代谢、蛋白质降解以及细胞防卫等过程,推测转OsNAS1 基因的甘蓝型油菜的耐盐性可能与这些生理生化代谢有关. 研究结果为揭示转基因油菜耐盐机理提供了理论依据.     

人工改造的Cry1Ac和Cry1Ie基因在烟草中共表达对棉铃虫有更好的杀虫活性

利用叶盘转化法获得了携带Cry1Ac, Cry1Ie和同时携带这两个基因的3种类型转基因烟草. 利用ELISA法测定转基因烟草叶片中Bt蛋白含量, 在携带两种Bt基因的转基因烟草中, Cry1Ac和Cry1Ie蛋白分别占总蛋白的0.173%和0.131%. 在携带单个基因的烟草中, Cry1Ac和Cry1Ie蛋白的含量分别为0.182% 和0.124%. 分别用野生型棉铃虫(Helicoverpa armigera)和Cry1Ac抗性棉铃虫的初孵幼虫在这3种类型的转基因烟草叶片上进行虫试, 并以未转基因烟草为负对照. 实验结果表明, 携带Cry1Ie基因的转基因烟草对这两种棉铃虫都有杀虫活性, 而携带Cry1Ac基因的转基因烟草仅对野生型棉铃虫有抗性, 携带两种Bt基因的烟草比仅含其中一个基因的烟草对这两种棉铃虫均有更好的杀虫效果. 该结果表明, 这两种Bt基因在转基因烟草中能够协同作用, 提高了烟草对害虫的杀虫效果. 同时, 转入两个Bt杀虫基因有可能成为延缓农业害虫对转基因作物产生抗性的新途径.     

农杆菌介导法获得转pac1基因小麦并表现对大麦黄矮病毒的抗性

自裂殖酵母中克隆得到pac1基因, 与GenBank中相关的核苷酸序列有99.3%的相似性. 编码蛋白质序列分析表明, 其具有RNaseⅢ结构域和双链RNA结合结构域. 体外活性测定表明, 以pET-5a系统在大肠杆菌中表达的pac1产物能够降解dsRNA. 将pac1导入双元载体pBI121, 以培养7~10 d的小麦幼胚为受体材料, 利用农杆菌株LBA4404对小麦品种陇鉴127进行转化, 获得了41株G418抗性植株, 经点杂交(dot blot)、RT-PCR和nptⅡELISA检测证实, 其中25株整合有外源基因并能正常表达. 对这25株转基因小麦进行大麦黄矮病毒的抗性鉴定表明, 有12株表现低度抗性, 表现为低接毒量时无症状, 接毒量提高时发病且严重; 有12株表现中度抗性, 表现为低接毒量时无症状, 接毒量提高时局部有不严重症状; 有1株表现高度抗性, 两种情况下均无症状. 抗性实验结果表明了pac1介导的抗性具有剂量效应的特点.     

丛枝-泡囊菌根真菌——中国球囊霉在离体条件下的生长和产孢

丛枝-泡囊菌根(Vesicular-arbuscular mycorrhizae,VAM)真菌在离开寄主组织条件下的纯培养一直没有得到很好的解决,致使这类真菌的分类、遗传和生理研究以及它们在生产上的应用都有很大的局限性。由于VAM真菌在生产上应用的潜能,关于它们的纯培养及接种