葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高效分泌表达

为了获得高效分泌表达葡萄糖氧化酶(GOD)的毕赤酵母,采用黑曲霉来源的GOD基因序列,按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化,构建AOX1启动子诱导的分泌表达载体pPIC9K-GOD和重组菌G/GOD,通过提高遗传霉素G418浓度筛选到第1代高拷贝高产量重组菌G/GODM,单位细胞干重胞外产酶水平可达5843.2 U/g,...     

人载脂蛋白基因apoAⅠ在毕赤氏酵母中的表达

将化学法合成的apoAⅠ基因插入分泌型载体 pPIC9K .将重组的 pPIC9K apoAⅠ用BglⅡ酶切后 ,转化PichiapastorisGS115菌株 ,筛选获得G4 18高抗性转化子 .转化子经摇瓶发酵和甲醇诱导 ,上清液用SDS PAGE检测 ,有明显的rApoAⅠ表达 .经Phenyl sepharose 6 (FastFlow)疏水层析柱和SephadexG 5 0 (coarse)分子筛层析 ,得到rApoAⅠ蛋白纯品 .经Westernblotting ,N末端氨基酸顺序测定证明 ,毕赤氏酵母表达的rApoAⅠ与人血浆提取的ApoAⅠ基本一致 .     

人载脂蛋白基因apoAⅠ在毕赤氏酵母中的胞内表达

将PCR扩增得到的apoAⅠ基因片段插入胞内表达质粒pPIC3.5K,重组的pPIC3.5K apoAⅠ用BglⅡ酶切后,转化PichiapastorisGS115菌株,筛选获得G418高抗性转化子,再通过PCR鉴定证实apoAⅠ基因已整合到染色体上.其转化子经摇瓶发酵和甲醇诱导,收集细胞裂解后,用SDS PAGE与Westernblotting检测,证明胞内有明显的rApoAⅠ表达,其分子质量与人血浆提取的ApoAⅠ相同.     

酵母Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及活性测定

酵母Elp3是Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸.生物信息学分析及有关研究表明Elp3除组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)活性外,可能还拥有组蛋白去甲基化酶活性.本文以yElp3的pYES2yElp3质粒为模板,PCR获得yElp3基因全长,插入改造过的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析及G418筛选获Mut+型多拷贝整合菌,经0.5%的甲醇诱导和Ni-NTA纯化,得到目的蛋白并对其进行体外酶活测定.SDS-PAGE分析表明yElp3在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,Western印迹证实得到的蛋白为yElp3.OPA法测得纯化蛋白拥有较好的HAT活性,具有生物活性的Elp3蛋白的获得为体外测定其第二结构域是否有催化活性奠定了基础.     

乙肝表面抗原在分泌型毕赤酵母中的表达及纯化

目的对分泌型毕赤酵母中表达乙肝表面抗原并进行亲和层析纯化。方法从已确诊的乙肝患者阳性血清中提取乙肝病毒DNA,PCR扩增乙肝病毒表面抗原编码基因S,将其插入含有仅分泌信号肽序列和6个组氨酸纯化标签的毕赤酵母表达载体pPICZα,成功构建了重组表达载体pPICZα—HBVs。电转化酵母菌株GS115,得到重组乙肝表面抗原S的酵母表达菌株。结果诱导培养基BMMY中甲醇终浓度为1％,诱导表达48h重组蛋白表达量及抗原性达到最高。非变性条件下亲和层析纯化后,薄层扫描分析得到纯度超过95％,表达量约为2mg／L的重组蛋白。结论Western-blot和ELISA分析表明,所得产物为乙肝表面抗原S蛋白,其纯度和产量足以免疫小鼠制备单克隆抗体。     

人甲状旁腺素在甲醇毕赤酵母中的分泌表达

选用酵母偏爱的密码子，人工合成长度为282bp的人甲状旁腺素(hFTH)基因，将其克隆于M13载体中，DNA测序验证正确。通过PCR从含有hFTH基因的M13载体获得了该基因，将其插入到含有AOX1启动子和α因子信号肽序列的表达载体pPIC9K中，构建了重组质粒pPIC9K-hFTH，电击法转化甲醇毕赤酵母(Picha pastoris)GS115菌株，经G418筛选得到高拷贝转化子，甲醇诱导表达，Tricine-SDS-PAGE电泳结果表明在9．3kDa处有明显的诱导蛋白带，与报道的hFTH的相对分子质量相近；酶联免疫沉淀法(ELISA)检测证明表达的蛋白具有hFTH免疫活性为132ng／L。     

突变型hGM—CSF在毕赤甲醇酵母中的分泌表达

临床研究发现，与大肠杆菌体系生产的hGM-CSF相比，利用酵母表达系统生产的hGM-CSF，具有毒副作用小等优点，鉴于非糖基化的hGM-CSF生物活性比人体天然产生的糖基化GM－CSF活性更高，采用PCR定点突变的方法修改hGM-CSF基因中的糖基化位点，进而在毕赤酵母（Pichia pastoris）中实现该突主型基因的高效表达。实验结果表明，突变型基因的表达产物具有天然hGM-CSF的活性。     

人载脂蛋白基因αpoAⅠ在毕赤氏酵母中的胞内表达

将PCR扩增得到的αpoAⅠ基因片段插入胞内表达质粒pPIC3．5K，重组的pPIC3．5K-αpoAⅠ用BglⅡ酶切后，转化Pichia pastoris GS115菌株，筛选获得G418高抗性转化子，再通过PCR鉴定证实口αpoAⅠ基因已整合到染色体上．其转化子经摇瓶发酵和甲醇诱导，收集细胞裂解后，用SDS-PAGE与Western blotting检测，证明胞内有明显的rApoAⅠ表达，其分子质量与人血浆提取的ApoAⅠ相同．     

人Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及HAT活性测定

人Elp3蛋白(human Elongator protein 3,hElp3)是组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸,其功能异常与人类多种疾病相关.目前对其羧基末端高度保守的第二功能域研究较少.以pYES2hElp3质粒为模板,PCR获hElp3基因全长,插入改造的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母菌GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析和G418筛选得到Mut+型多拷贝整合菌.0.5%的甲醇诱导hElp3高效分泌表达,Ni-NTA纯化及Western印迹证实获目的蛋白.OPA法测得其拥有良好的HAT活性,为体外测定其第二结构域是否拥有催化活性奠定了基础,对筛选抑制其HAT活性的小分子药物用于疾病治疗研究至关重要.     

猪胃蛋白酶原A在毕赤酵母中的表达

利用已有的猪胃蛋白酶原AcDNA,构建毕赤酵母pPIC3.5K-pA胞内表达载体.经纤维蛋白消化试验和干酪素琼脂平板法筛选,获得两株高表达的重组子,研究它们在不同pH值、不同诱导时间、不同起始浓度和不同甲醇诱导浓度等条件下表达水平的高低.结果表明:在pH值为7、诱导72h、起始诱导浓度的OD600为2、甲醇诱导浓度为1%时,重组胃蛋白酶活力最高,达到6.46U/mL.     

Monellin基因在酵母中的表达研究

本实验根据毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了高甜度monellin基因,并构建了重组分泌型酵母表达载体pPIC9KM,通过电击转化获得了可高效分泌表达有甜味活性高甜度monellin的重组毕赤酵母GS115/pPIC9M.通过PCR检测证实monellin基因已经整合进酵母基因组,SDS-PAGE和Westerm blot免疫杂交知所表达的蛋白是目的蛋白,最后通过双盲测定证实表达的蛋白比同等重量的蔗糖甜约1000倍.     

人胰激肽原酶在毕赤酵母中的分泌表达

人胰激肽原酶(hPK)编码基因由本实验室设计、合成,并重组构建成表达质粒pPIC9k-hPK。经电穿孔将该质粒转化毕赤酵母GS115 (His^-Mut⁺) ,筛选His⁺Mut^s 型高拷贝菌株,摇瓶诱导表达重组hPK。经SDS-PAGE凝胶电泳分析确定表达重组蛋白相对分子质量为37500,产量达40mg/L,质量分数占总蛋白的30%以上。初步浓缩的重组hPK经测定具有酶活性,表明其在毕赤酵母中得到了正确的表达,每mL酶活达0.717nmol/s。     

人载脂蛋白基因apoAI在毕赤氏酵母中的表达

将化学法合成的apoAI基因插入分泌型载体pPIC9K．将重组的pPIC9K—apoAI用BglⅡ酶切后，转化Pichia pastoris GS115菌株，筛选获得G418高抗性转化子．转化子经摇瓶发酵和甲醇诱导，上清液用SDS-PAGE检测，有明显的rApoAI表达．经Phenyl—sepharose 6(Fast Flow)疏水层析柱和Sephadex G-50(coarse)分子筛层析，得到rApoAI蛋白纯品．经Western blotting，N末端氮基酸顺序测定证明，毕赤氏酵母表达的rApoAI与人血浆提取的ApoAI基本一致．     

小鼠LEAP-2成熟肽基因在毕赤酵母中的分泌表达

实验利用已构建的分泌型重组表达质粒pPIC9-mmLEAP-2,氯化锂转化表达宿主菌GS115毕赤酵母;应用表型和PCR技术筛选高拷贝转化株。经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS—PAGE分析重组mmLEAP-2表达量,为进一步研究mmLEAP-2的活性奠定了基础。     

分泌性表达人rPA毕赤酵母工程菌株的构建及发酵条件的初步优化

通过PCR扩增得到组织型纤溶酶原激活剂突变体Reteplase(rPA)基因片断，将该基因片断插入到含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列载体pPIC9K中，构建了重组表达质粒pPICgK／rPA，转化Pichia pastoris GS115宿主菌．通过比较转化子在MM和MD平板上的生长状况，筛选His^ Mut^s表型转化子．并在2．0mg/mL G418平板筛选得到多拷贝转化子GR10，GR11．摇瓶培养，甲醇诱导外源基因表达，表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明重组蛋白分子量约39ku，能与特异性单克隆抗体发生免疫反应；体外气泡法测定rPA活性，结果显示重组蛋白具有较好的纤溶活性．通过正交试验，优化发酵条件，表达活性最高为1050IU／mL．     

人骨形态发生蛋白6(hBMP6)在毕赤酵母中的分泌表达

以重组质粒pcDNA6A-BMP6为模板PCR扩增hBMP6成熟肽cDNA编码序列,将该序列克隆到酵母分泌表达表达载体pPIC9K中.重组质粒pPIC9K-hBMP6经SacI酶切线性化,电击转化毕赤酵母GS115,PCR法筛选阳性转化子,利用梯度浓度G418筛选到七株高拷贝整合的阳性转化子。用甲醇进行诱导表达,SDSPAGE及Western-blot检测结果表明hBMP6成熟肽以分子量约为34和18 kD两种不同糖基化修饰的单体形式存在,具有良好的免疫原性.     

人骨唾液酸蛋白在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达

以PCR方法扩增人bsp基因，与分泌型表达载体pPICZαA重组，重组质粒经电击转化毕赤酵母GS115菌株，获得的GS115／pPICZαA－hbsp表达菌株能高效分泌表达rhBSP.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明，产物的分子质量接近66ku，能发生特异性抗原－抗体反应。     

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母中的分泌型表达及酶学性质初探

将南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA(含pAOX1启动子)和pGAPZαA(含pGAP启动子)中,转入毕赤酵母表达宿主KM71H,经三丁酸甘油酯平板活性筛选获得高效表达的酵母工程菌株.分泌型表达CLAB酵母工程菌的酶活较高,经摇瓶发酵96h后,CLAB活力达到11.1U/mL.经发酵罐高密度发酵84h后,CLAB活力达到179.2U/mL,蛋白质量浓度为1.36mg/mL.体积分数12%SDS-PAGE凝胶电泳显示重组CALB相对分子量为36kDa.该酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0.在pH7.5~9.5较稳定,经55℃保温1h,残余酶活还有48.5%.5mmol/LMg2+、Ni+、Co2+和体积分数0.10%SDS对CALB酶活影响很小,而Zn2+强烈抑制酶催化反应,体积分数0.05%TritonX-100对CALB稍有激活作用.     

重组人Endostatin在甲醇酵母Pichia Pastoris中的分泌表达

为了获得高效表达分泌型重组人Endostatin菌株 ,利用基因工程技术 ,将目的基因连接到Pichia表达载体 pPIC9K中 ,将该重组质粒转入GS115菌株后筛选His阳性菌株 ,并用G4 18筛选高拷贝阳性克隆菌 .重组表达的Endostatin经SDS PAGE电泳 ,可在分子量 2 2kD处见到单一目标带 .经体外生物学活性检测 ,Pichia菌株表达的Endostatin能有效地抑制培养的ECV30 4细胞及P6 1细胞的生长 .     

牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定

用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sepharose亲和层析一步纯化,从每升培养液可获得1.6mgEKLC,其纯度达90%以上.酶反应动力学结果表明,EKLC对小分子底物Gly＿Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿β＿naphthylamide的Km为(753±42)mol/L,kcat为(31.5±3.8)s-1.对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白(Trx＿hBNP)的酶解作用显示,当酶与底物重量比大于1∶100时,经37℃保温5h后,超过75%的融合蛋白被裂解.上述结果表明,EKLC能够特异识别并水解Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿肽键,是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.