人16型乳头瘤病毒"假病毒"的制备

利用杆状病毒表达体系,在sf9细胞中表达人16型乳头瘤病毒(Human Papillomavirus type 16, HPV16)的晚期表达蛋白L1,通过超速离心的方法得到HPV16病毒样颗粒(virus like particles, VLPs).VLPs经过DTT和EDTA处理解聚成L1蛋白,将构建好的真核表达载体E6E7-pcDNA3.1 与解聚的L1蛋白混合,透析除去DTT和EDTA并逐渐升高Ca2 的浓度,解聚的L1能够重新聚集成VLPs,其中一部分VLPs包裹了真核表达载体,和天然的人乳头瘤病毒的构成很相似,作者称之为"假病毒".     

人乳头瘤病毒假病毒制备方法的优化

人乳头瘤病毒假病毒可广泛应用于中和抗体鉴定和疫苗免疫性评估等研究.本研究对多质粒共转染293FT细胞生产HPV假病毒的方法进行了深入优化,结果显示不同的HPV结构蛋白表达质粒转染比例对于假病毒生产效率有显著的影响,HPV主要结构蛋白L1的表达水平是影响生产效率的主要因素,L2表达质粒的用量过高或过低均不利于假病毒的生产,而报告质粒的用量对假病毒生产效率的影响相对较小.综合比较显示,在该体系中L1和L2表达质粒和报告质粒以合适比例(如1:1/10:1/2)进行共转染可获得更为理想的生产效率.本研究同时也在293FT细胞中对磷酸钙转染方法进行了优化,通过磷酸钙与质粒用量的交叉配比试验获得了较优的转染条件.通过优化,建立了更为高效的HPV假病毒大量制备方法,在HPV16、HPV18、HPV6、HPV11假病毒生产中的应用结果显示较原方法可显著提高生产效率.本研究为HPV假病毒中和实验的规模化应用提供了有利条件.     

58型人乳头瘤病毒E7蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

 为获得抗58型人乳头瘤病毒(HPV58)E7蛋白的单克隆抗体,乳糖诱导重组工程菌表达HPV58 E7融合蛋白,以纯化后的该重组蛋白为免疫原,经细胞融合和有限稀释后,得到6株分泌抗HPV58 E7单克隆抗体(McAb)的工程细胞株,并采用体内接种方法及亲和柱层析纯化技术制备6株抗体.酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western-blot实验和细胞免疫荧光检测结果表明,所得抗体均为IgG2a类,κ型,抗体效价均可达10^-5,并且能够与原核及真核系统表达的HPV58 E7蛋白发生特异性抗原-抗体反应.该抗体的成功制备为后续HPV58 E7致癌生物学研究及相关肿瘤诊断试剂的开发奠定基础.     

利用His-杆状病毒表达系统制备HPV16L1VLP

目的　改进现有的昆虫细胞表达和纯化HPV16L1蛋白系统,寻找一种经济、简便、省时的HPV16病毒样颗粒(VLP)疫苗的制备方法。方法　将HPV16L1基因重组入带有 6×His标签的杆状病毒基因组, 并转染昆虫细胞 (Sf 9)进行表达。用镍柱纯化表达蛋白;以小鼠红细胞凝集试验和凝集抑制试验鉴定蛋白生物活性,用透射电镜观察VLP形成。结果　使用新的表达和纯化系统获得HPV16L1高效表达。小鼠红细胞凝集试验和凝集抑制试验证实纯化的HPV16L1蛋白具有HPV16L1的生物学活性;透射电镜观察证实纯化蛋白可自组装成VLP。结论　带有 6×His短肽的HPV16L1蛋白具有与HPV16L1蛋白同样的生物学活性和自组装成VLP的能力,现时的表达纯化系统,提供了一个省时、省力、简便、经济的制备HPV16VLP疫苗的方法。     

人乳头瘤病毒疫苗的研究策略及最新进展

人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染与多种皮肤粘膜肿瘤密切相关，研制有效的病毒疫苗成为研究者的共同目标。本文系统综述了人乳头瘤病毒疫苗在预防和治疗两方面的研究策略以及动物和临床试验的新进展，主要包括旨在预防高危型病毒感染的二价疫苗，临床试验，交叉中和表位的研究，增强治疗性疫苗免疫原性的新尝试以及树突状细胞在病毒感染局部免疫作用中的新发现。     

人乳头瘤病毒11型E7 DNA疫苗质粒的构建和鉴定

目的 构建人乳头瘤病毒11型(HPV11)E7 DNA疫苗质粒．方法 从尖锐湿疣病变组织中提取DNA制备模板，采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增HPV11-E7基因，将E7基因经双酶切后定向克隆到pcDNA3．1( )中，测序鉴定．结果从病变组织中扩增出了全长HPV11-E7基因，并正向插入载体pcDNA3．1( )中，经酶切和测序鉴定无误．结论 HPV11-E7 DNA疫苗质粒构建成功，为今后进行防治尖锐湿疣的动物实验和临床实验奠定了基础．     

人乳头瘤病毒16和52型双荧光等温多自配引发扩增的

应用等温多自配引发扩增（IMSA）技术, 分别针对人乳头瘤病毒(HPV)16型的E7和52型的E6基因序列设计6条特异性引物, 并在检测体系中加入羟基萘酚蓝（HNB）和SYBR GreenⅠ的混合双荧光指示剂, 建立快速检测人乳头瘤病毒的双荧光IMSA方法. 结果表明： 340 μmol/L HNB与1∶10 000 SYBR GreenⅠ混合构建的双荧光指示剂在IMSA反应体系中具有明确的指示效果, 455 nm蓝光激发下阳性反应管双荧光显色为黄绿色, 阴性反应管双荧光显色为橘红色; 该方法对HPV16和HPV52型检测限分别达60,600拷贝/μL, 可特异性检出样品中HPV16和HPV52, 与临床检测结果比对无差异.     

成都地区人乳头瘤病毒型别分布研究

应用反向膜杂交技术对1668例标本进行型别鉴定和统计分析.在1668例标本中,共检出阳性标本673例,感染率为40.3%;其中单重感染512例,占阳性标本的76.1%,双重感染96例,占阳性标本的14.3%;单重感染中的高危型感染318例,占阳性标本的47.3%,低危型感染194例,占阳性标本的28.8%.结果表明成都地区HPV感染率较高,且以单一基因型感染为主,其中HPV-16感染率最高,其次是HPV-18,低危型HPV感染以HPV-6和HPV-11为主.     

人乳头瘤病毒疫苗的研究进展

人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)广泛感染人类,能够导致宫颈癌等恶性肿瘤的发生,严重危害人类的健康.HPV疫苗能够有效阻止HPV感染及其导致的疾病,世界卫生组织正在实施全球消除宫颈癌的计划.本文结合厦门大学在HPV疫苗研发中取得的研究成果,综述了HPV及其疫苗研究领域的进展,包括HPV的生...     

广东地区HPV16型L1基因的序列分析及其毕赤酵母表达载体的构建

目的: 分析广东地区人乳头瘤病毒(HPV)16型L1基因结构特点;构建广东分离株HPV16 L1毕赤酵母分泌型表达载体.方法:采用PCR技术从广东地区宫颈癌组织中扩增HPV16 L1基因,克隆入毕赤酵母表达载体pPICZαC,测序并对HPV16 L1基因进行序列分析.结果:成功扩增了广东地区HPV16 L1基因,并构建了其毕赤酵母表达载体pPICZαC-HPV16 L1.广东分离株HPV16 L1基因序列与德国标准株相比有16处不同,同源性为98.99%,其编码的氨基酸序列有8处发生改变;与中国标准株比较有9处不同,同源性为99.18%,其编码的氨基酸序列有4处发生变化;发现在HPV16 L1基因序列中nt5 649、nt5 652、nt5 654、nt5 657、nt5 692、nt5 693,6个位点存在突变.结论:广东地区HPV16 L1基因序列与德国标准株、中国标准株相比较均存在差异;成功构建广东地区HPV16 L1真核表达载体.     

人GrnE单克隆抗体的制备和鉴定

为了制备获得针对人Grn E单克隆抗体,将原核表达GST-Grn E蛋白作为免疫原,免疫Balb/c小鼠,经过融合及初步筛选,获得5株针对Grn E的单克隆细胞株.选取其中3株(1D5、2E1和3F7)制备腹水,并通过western blot和免疫荧光染色对该3株单克隆抗体进行鉴定.在此基础上,进一步对1D5和3F7两株单克隆抗体是否可以用于免疫沉淀实验进行了检测.上述实验表明,本研究成功制备了针对Grn E结构域的单克隆抗体,而且所制备的单克隆抗体具有良好的特异性.     

抗人FXYD3单克隆抗体的制备与初步鉴定

【摘要】目的 制备抗人FXYD3单克隆抗体（McAb）并鉴定其生物学特性。方法 以固相合成法获得的FXYD3合成多肽与载体蛋白KLH偶联后免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗人FXYD3 McAb。用ELISA 、Western Blot、免疫组化技术对抗人FXYD3 McAb的亚型、效价、亲和力及特异性进行鉴定。结果 筛选出两段较好的优势抗原表位,分别为NDLEDKNSPFY和KFGQKSGHHPGETPPLITPGSA获得四株可稳定分泌抗人FXYD3 McAb的杂交瘤细胞株02A12C4、02F1E8、02E6B10与03A10E11,亚型鉴定重链均为IgG1,轻链为kappa链。间接ELISA法测定效价均在为1∶104以上。其中02F1E8效价为1∶105以上,亲和常数为3.11?08 L / mol。免疫组化分析显示了FXYD3均匀分布于肝癌细胞与人胰腺癌Bxpc-3细胞系细胞的胞膜上。结论 成功制备了四株抗人FXYD3 McAb,其中02F1E8纯度好、效价高及特异性强。为进一步研究FXYD3在肿瘤组织及细胞系中的表达及临床意义奠定了基础。     

兔抗PEB1多克隆抗体的制备及鉴定

摘要：【目的】利用纯化的空肠弯曲菌表面蛋白PEB1,制备其多克隆抗体。【方法】用PEB1蛋白作为抗原免疫兔,分离血清得到兔抗PEB1多克隆抗体,用ELISA法检测抗体效价,并用Western-Blotting验证。【结果】PEB1蛋白免疫兔后,得到了兔抗PEB1多克隆抗体,间接ELASA法检测表明兔抗PEB 1血清效价达到1：10 000,Western印记检测表明,该抗体能与PEB1蛋白发生特异性结合,其特异性与敏感性均较好。【结论】获得了高效价的PEB1多克隆抗体。     

VMP1基因的克隆及其抗体的制备与鉴定

为了得到效价高、特异性强、能用于检测内源性VMP1蛋白的抗体，采用RT-PCR法，从L929细胞株中克隆鼠VMP1基因，重组入pCMVS载体，用PCR扩增与其氨基酸132-239区域对应的DNA片断，将该片段连接到原核表达载体pGST parallel中，在大肠杆菌BL21菌株中大量表达，经谷胱甘肽-琼脂糖树脂纯化后，得到高纯度的VMP1抗原．免疫新西兰兔，获得抗VMP1蛋白的兔抗血清，将血清纯化后即得到抗VMP1的多克隆抗体．用Western blot分析手段检测了该抗体的特异性及效价．在用该抗体检测外源性和内源性VMP1蛋白的试验中，证实该抗体效价高，特异性强，效果很理想．此方法可用于获得大量廉价的抗VMP1蛋白的高滴度和高特异性的抗体，为进一步研究VMP1在细胞内，尤其是在信号转导通路中的功能和作用奠定了基础．     

三聚氰胺多克隆抗体的制备及鉴定

用三聚氰胺偶联蛋白为抗原,按不同的时间规律及抗原剂量对成年兔进行免疫,获得特异性的三聚氰胺多克隆抗体.效价检验应用蛋白质电泳和间接ELISA方法.应用10%及12.5% SDS-PAGE,验证血清中IgG抗体的产生情况,再用间接酶联免疫吸附试验测得第4次免疫后抗体效价达到1.2×107.此法易于实施,且获得的血清样品具有较高的效价,为今后三聚氰胺多克隆抗体的分离纯化提供了可靠的实验依据.     

抗羊布鲁菌核糖体蛋白L7/L12单克隆抗体制备及初步鉴定

制备抗羊布鲁菌核糖体蛋白L7／L12的单克隆抗体（mAb）,为进一步研制布鲁菌检测方法和免疫制剂提供基础。常规动物免疫、细胞融合、克隆化制备抗核糖体蛋白L7／L12的mAb,并用Western blot和ELISA方法对其特异性、抗原识别表位及相对亲和力等做了初步鉴定。获得了4株抗L7／L12蛋白的mAb：1B1,2A2,2H9和2H10,相对亲和力为2A2〉2H10〉2H9〉181,4株mAb识别的抗原表位相近,但仍存在一定的差异。得到的4株稳定的杂交瘤细胞系分泌的mAb能特异结合L7／L12蛋白。     

烟草花叶病毒单克隆抗体的制备和鉴定

经工程菌表达与纯化,得到了纯度95%以上的TMV-CP-F重组蛋白,配合提取的TMV天然病毒颗粒作为免疫原.通过杂交瘤技术获得了14株能分泌特异针对TMV外壳蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株.经鉴定14株细胞所分泌的抗体亚类为IgG1型,抗体轻链均为κ型.经ProteinA一步法亲和层析纯化所得抗体经鉴定相对分子质量在149.36～157.23 ku之间,抗体纯度在80%以上.经间接ELISA测定,14株抗体均与TMV-CP重组蛋白和TMV病毒有良好特异性反应.所制备的抗TMV抗体的特异性高,可用于与其相关的免疫检测研究和应用.     

磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶单克隆抗体的制备和鉴定

 为建立磺胺类药物残留的免疫化学分析方法,利用磺胺甲基嘧啶(SM)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)分子结构中的芳香氨基,采用重氮反应和戊二醛法将其与载体蛋白(牛血清白蛋白和鸡卵清蛋白)交联制备抗原,最终获得5株抗SM和18株抗SM2杂交瘤细胞株.对杂交瘤细胞株的核型、抗体的亚类和轻链型、抗体的异相包被ELISA反应性以及抗体的竞争反应性和交叉反应性进行了分析和评价.其中SM抗体11C8结合SM的竞争抑制质量浓度IC50为14.1μg/L,与类似物SD的交叉反应性接近20%,但与其他类似物低于10%.SM2抗体中的6株抗体的竞争抑制质量浓度IC50在38.8~70.0μg/L范围内,2B7,4D5,13C9,14C5和16C2抗体与类似物SM的交叉反应性达到73.5%~132.9%,而15D10抗体与SM的交叉反应性低于5%.因此,本研究所获得的磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶抗体,可用于SM和SM2残留的免疫分析方法研究和应用.