褐飞虱细胞色素P450基因cDNA片段的克隆、测序及表达分析

利用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术克隆了褐飞虱细胞色素P450基因编码区的cDNA片段,并进行了序列测定.结果表明,所克隆到的cDNA片段长度为237bp,经BLAST查找比对发现,该片段所编码的氨基酸序列与来自烟草天蛾、棉铃虫、埃及伊蚊、家蝇、黑腹果蝇和线虫的CYP6家族的P450的氨基酸序列存在同源性.Northern杂交分析显示,在褐飞虱取食抗性水稻后,P450基因的表达水平明显升高.以上结果表明,P450基因的表达受抗性水稻的诱导,该基因在褐飞虱对抗性水稻的耐受性和解毒方面可能起着重要作用.     

盐胁迫下盐藻特异表达基因片段的克隆

盐碱、干旱、极端温度等逆境条件是影响植物生长的重要因素。以抑制消减杂交及差式库的筛选对盐藻（Dunaliella salina)在高渗胁迫下特异表达基因片段进行了克隆。比较长期（1周,LS）及短期（16h,SS)NaCl胁近条件下基因表达情况,前者克隆到2个特异表达片段,后者也有2个。通过测序及Gene Bank中进行同源搜索,均未有可靠的同源性结果。可以初步认为,以上得到的4个cDNA可能是新基因或此片段不在保守区内。     

甜菜夜蛾P450基因的克隆及组织特异性分析

为获得甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hübner)P450基因序列并分析其分布的组织特异性,采用同源克隆结合RACE技术克隆得到了该基因的cDNA全序列:全长2565bp,包含1010bp的3’非编码区域和42bp的5’非编码区域,开放阅读框(ORF)长1515bp,编码504个氨基酸,分子量为57.74kD,理论等电点为8.01;包含2个糖基化位点,2～21aa为跨膜结构.同源比对结果表明,SeP450与其它昆虫的P450基因拥有同样的2个保守结构域:CAFG、AG\ET.SeP450与棉铃虫蛾HelicoverpaarmigeraP450同源性最高,达74％;系统发育分析也表明二者亲缘关系较近.同时RT-PCR结果显示SeP450mRNA在中肠、脂肪体等多种组织中都有表达,其中中肠表达量最高.     

胎儿左右大脑差异表达基因片段的克隆

应用抑制性消减杂交（ＳＳＨ）技术从一２４ 周流产男性胎儿的左右大脑ｍ ＲＮＡ 中克隆到了４２ 个左脑特异表达基因的ｃＤＮＡ 片段，并随机挑选１５ 个克隆的测序结果与美国ＮＩＨ 基因库ＥＳＴ进行了同源性分析，同源性范围是６４％ ～１００％ ，其中有５ 个克隆的基因库同源序列与脑有关，其余１０ 个克隆同源于脑以外的其它组织．     

CYP725A4分子序列分析与结构建模

CYP725A4在大肠杆菌等原核宿主中难以实现高效功能表达,是制约紫杉醇异源合成的瓶颈之一.文中利用生物信息学方法对该酶分子的序列进行疏水性和跨膜区分析,构建了其分子进化树,在此基础上用同源建模方法构建了其天然态以及切除N端跨膜区后的三级结构,并对CYP725A4实现功能表达所必需的辅助还原酶也进行了天然态和切除N端跨...     

新型通用探针LDR分型技术的开发及细胞色素P450基因多位点分型

构建了一种可同时对多个位点进行基因分型的新型通用探针连接酶检测方案．与普通的连接酶检测方案相似．具有灵敏度高和特异性强的特点．但降低了50％～90％的探针设计与合成成本。利用该方案对115例正常中国人的细胞色素P450系统的6个位点进行基因分型．样本测序与基因频率的统计学分析验证了该方案准确可靠。     

植物基因差异表达的研究方法及进展

对目前在植物基因差异表达研究领域主要采用的消减杂交,DDRT-PCR,cDNA-RDA,cDNA-AFLP,SSH,基因芯片和SAGE等研究方法的原理、特点、研究进展以及发展趋势进行了综述.这些方法各有特点,可根据研究工作的需要选择合适的研究方法.     

鸡与鹌鹑杂交种早期胚胎发育特异表达基因的初步筛选

利用mRNA差异显示技术，对入孵67～91h的鸡（♀）与鹌鹑（♂）杂交种胚胎中mRNA差异表达进行比较，筛选出与杂交种胚胎早期发育相关的特异表达基因，并克隆测序这些序列，分析这些基因在杂交受精蛋早期胚胎发育中的作用，及其对杂交种早期胚胎死亡是否有影响。分析结果表明，已经获得6个杂交种孵化不同时期的基因片段与鸡的mRNA序列具有高度同源性。其中，孵化第72h时胚胎mRNA表达的序列与鸡雌激素受体结合位点相关抗原mRNA具有高度同源性，孵化第79h时产生的差异片段经过比对，发现：与鸡（♀）肽酰-脯氨酰异构酶类似的mRNA序列具有高度同源性。而杂交种胚胎发育到第72h时，可检测到鸡雌激素受体结合位点相关抗原mRNA的表达，比前人所得到的表达时间（胚胎发育在第84h时检测到）提前了12h，这很可能是造成杂交种早期胚胎大量死亡的原因之一。     

筛选差异表达基因的方法进展

植入前胚胎差异表达基因的筛选是分离、鉴定发育相关基因的关键 ,是克隆动物发育分子机理研究的基础 .哺乳动物植入前胚胎和克隆胚胎材料的获得十分不易 ,使得筛选差异表达基因的方法在该领域的应用均受到较大的限制 .以DDRT -PCR为基础的单胚mRNA差异表达技术的建立 ,为克隆植入前胚胎发育相关基因及哺乳动物克隆胚胎发育分子机理研究提供有力的工具 ,本文将在多年研究基础上对该技术及目前筛选差异表达基因的方法进行综述 .     

抑制性差减杂交筛选差异表达基因方法初探

抑制性扣除杂交技术是一种基因我隆的新方法,它对研究细胞生殖,发高效能 ,分化,癌变,衰老及程度化死亡吸关基因的差异表达以及相关基因的分子克隆提供了有力的工具,结合进行 的用SSH法筛选与砷代谢相关的实验,主要介绍了抑制性扣除杂交技术的主要原理,基本过程,优越性,主要缺陷及目前最新的研究进展。     

应用抑制性消减杂交技术构建人肝癌组织特异表达cDNA文库

为克隆和筛选肝癌特异表达基因.应用抑制消减杂交技术对肝癌及癌旁组织进行消减杂交,产物PCR扩增后,进行克隆.共得到1820个克隆,1776个克隆有100~800bp的插入片断,阳性率达98%,说明人肝癌组织特异表达cDNA消减文库构建成功,同时我们对cDNA克隆进行测序,证明这些克隆的功能是和肝癌的发生高度相关的.抑制消减杂交是克隆特异表达基因的有效方法.     

抑制性扣除杂交(SSH)技术原理及在水稻基因表达差异分析中的应用

抑制性扣除杂交法运用了杂交二极动力学和链内退火优先于链间的原理，使原丰度有差别的单链cDNA相对含量基本一致，使非目的片段两端反向重复序列退火时产生“发卡”结构，不能与引物配对，从而选择性地抑制了非目的片段扩增。该方法假阳性率低，灵敏度高，在水稻基因表达差异分析中有着广泛的应用。     

湖北地区人群的CYP2D6二倍体多态性基因分析

使用长模板PCR方法检测 2 2 3例湖北地区人群中CYP2D6二倍体 .在被检人群中 ,CYP2D6二倍体的基因频率为 2 .7% .检测到 6例CYP2D6二倍体 ,基因型分别为 1× 2 (3/ 6 ) , 2× 2 (2 / 6 ) ; 10× 2 (1/ 6 ) .表明湖北地区人群中CYP2D6二倍体的基因频率比其他地区中国人群稍高     

利用DGE技术筛选雌雄鹌鹑胚胎发育至第3天与性别分化相关的差异表达基因

为了研究鹌鹑早期性别分化时期基因的表达情况,本研究利用数字表达谱技术(DGE)对发育至第3天的雌性鹌鹑胚胎和雄性鹌鹑胚胎进行研究。结果显示:建立了雌性鹌鹑胚胎和雄性鹌鹑胚胎2个DGE文库,对比分析后得到了34个差异表达的基因,其中雌性胚胎相对于雄性胚胎10个为上调基因,24个为下调基因,通过对这些差异基因进行GO/KO富集性分析,筛选出了4个跟性别分化相关的基因,分别为HINT1、ASW、HSD17B4基因和未知功能的ID为ENSGALG00000013312的基因。     

干旱胁迫下开花期玉米消减文库的构建及分析

分别以1d干旱和7d干旱处理的开花期玉米顶叶cDNA为tester,正常生长的玉米顸叶cDNA为driver,利用抑制性差减杂交技术构建了两个干旱胁迫下开花期玉米消减文库．两个文库的重组率均高于95％,插入片段集中在300—600bp之间．对两个文库部分克隆进行测序发现,文库中含有脱水素、蔗糖合成酶、甜菜碱醛脱氢酶。DRE结合因子等大量的抗旱相关基因,说明两个干旱胁迫下开花期玉米抑制性消减文库已经构建成功。且具有重要意义．     

穿山龙液泡H+-ATPase c亚基基因片段的克隆

利用抑制消减杂交（SSH）和SMART技术，构建了3年生和1年生穿山龙（Dioscorea nipponica）根组织mRNA群体间正向差减cDNA文库．从34个随机测序的cDNA克隆中，发现了1个编码液泡H^＋-ATPase（V-H^＋-ATPase）c亚基的克隆，并命名为DnvHAc1（Accession No：DN792564）．序列同源性分析表明，其cDNA序列长486bp，3’端具有PolyA结构，其编码的氨基酸序列（115个氨基酸残基）也与多种植物的液泡H^＋-ATPase c亚基（16kDa proteolipids）具有较高同源性，具有3个跨膜疏水结构域，结构域Ⅲ为功能保守的区域，有dicyclohexylcarbodimide（DCCD）结合位点，Glu-92在调节液泡H^＋-ATPase具有重要作用．该研究结果为克隆其全长基因和进一步研究其在薯蓣皂甙次生代谢生物合成中的功能提供了重要的实验基础．