同源重组在染色体DNA基因克隆中的应用方法

同源重组是生物界普遍存在的现象，从噬菌体、细菌到真核生物都有能发生同源重组的种类。如何把同源重组应用到基因克隆中成为近年来生物学家研究的热点。本文从宿主细胞的改造、重组功能的诱导、感受态细胞的制备、线性同源载体的获得及重组体的鉴定等几个方面具体叙述这种基因克隆的新方法，从分子水平上较为详尽地介绍了同源重组在染色体基因克隆中的应用、前景展望及存在的局限性。     

水稻同源重组型质粒载体的构建

根据同源重组机制,以水稻17S-5.8SrDNA 2.5 kb 同源片段和含有MT基因、Km r 基因的外源DNA片段构建了质粒载体pURKMT,并用电激法转化水稻愈伤组织,经Km 筛选,获得了对Km 抗性明显高于基础抗性的愈伤组织.经DNA斑点杂交检测,证实外源基因已整合到水稻基因组DNA中.     

一种高效的酿酒酵母和毕赤酵母电击转化法

 电击转化由于其高效率而被广泛地应用于酿酒酵母的转化过程中。但是由于菌种退化或是暴露于污染的环境,很多菌种的转化效率会显著地下降2~4个数量级。探索了一种改进的电击转化方法,它借助于单链载体DNA和转化后在YPD培养基中的复苏过程,可以使转化效率比之前曾报道过的已经最优化的用醋酸锂和二硫苏糖醇进行预处理的转化方法效率提高13倍。在毕赤酵母中使用这一改进的方法,可以使转化效率提高高达114倍,在一些已经退化的酿酒酵母菌株中,此方法也可以提高转化效率将近100倍。这一方法将为几乎所有酿酒酵母和毕赤酵母的分子操作提供极大的便利。     

腺病毒同源重组子的鉴定

携带入ＩＦＮ－γｃＤＮＡ序列的Ｅ１区缺失的腺病毒载体ｐＡｄｌ２／ＲＳＶ－ＩＦＮ－ｂｐＡ与ｐＪＭ１７质粒，通过磷酸钙沉淀法共转染２９３细胞，经同源重组，共获得６个病毒噬斑。病毒噬斑感染２９３细胞，至出现完全细胞病变效应（ＣＰＥ）后，抽提细胞内的病毒ＤＮＡ，经ＸｈｏⅠ酶切后走凝胶电泳，出现重组腺病毒圾的３．５ｋｂ大小的ＤＮＡ条带，＾３２Ｐ标记的探针ｐＡｄｌ２／ＲＳＶ－ＩＦＮ－ｂｐＡ与ＸｈｏⅠ酶切过的病     

含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的家蚕同源重组质粒载体的构建

以含家蚕丝心蛋白重链基因同源片段的质粒pG350为出发质粒，插入增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因，构建成以EGFP为报告基因的同源重组质粒载体pMD-Fib-IE-EGFP，通过PCR及酶切鉴定表明EGFP以正确的方式插入到原始质粒中，通过脂质体介导法转染胃癌细胞能发出很强的绿色荧光，表明该质粒能够在真核细胞中表达，为进一步建立完善的家蚕转基因系统平台提供基因材料。     

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）同源DNA片段的克隆

利用作者克隆的酿酒酵母基因启动子片段Ｙ８为探针和菌落原位杂交方法，从构建的Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＹＮＮ２７基因组文库中共筛选８个阳性克隆。根据这些克隆中插入片段大小和限制酶切结果，可将其划分为６种，分别命名为ＹＮ１－ＹＮ６．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交结果表明，这６种ＤＮＡ片段不仅能与６．５ｋｂ的全长Ｙ８探针我，而且均能与ＰｓｔＩ酶切Ｙ８所得的３段ＤＮＡ探针杂交。     

酿酒酵母细胞四种转化方法的比较

1978年 ,Hinnen等和 Begges首先报道了酵母原生质体转化方法 [1 ,2 ] .该方法的优点是转化效率较高 ,但此方法容易形成多倍体细胞 ,且细胞再生困难 .后有人在此基础上进行改进[3] ,虽提高了转化效率 ,减少了多倍体细胞的形成 ,但菌落再生时间较长 ( 4～ 6d) .Ito等提出了不完全破坏细胞膜的完整酵母细胞的转化方法 ,并对多种金属离子对转化效率的影响进行研究 [4] .进入 90年代后 ,人们在 Li Ac的加入量、热冲击时间、PEG4 0 0 0的浓度等方面进行了改进 [5～ 7] .本文选取了四种不同的转化方法进行比较 ,以期找到最佳的转化方法 .1　材…     

用于骨移植的hCbfa1重组腺病毒载体的构建

克隆hCbfa1的cDNA基因,构建其重组腺病毒载体,以用于研究hCbfa1腺病毒载体在人造骨移植中的作用.将hCbfa1的cDNA目的片段插入腺病毒柯氏质粒PAxCAwt中,再将此质粒与腺病毒DNA末端蛋白复合物共转染293个细胞,通过同源重组构建hCbfa1重组腺病毒载体.重组得到的阳性克隆经酶切、测序鉴定正确,包装纯化后,检测得病毒滴度为2×109PFU/mL,从而成功地构建了hCbfa1重组腺病毒载体,为下一步应用到人造骨移植的转基因治疗打下了基础.     

重组DNA技术在酿酒酵母遗传操作中的应用

在传统的食品和酿造工业中，酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）占有十分重要的地位。如今，这种简单的单细胞真核生物已成为遗传研究的一种模式。本文简要综述了重组DNA技术应用于酿酒酵母遗传操作的研究进展，并指出了重组DNA技术作为新的遗传操作的手段，其应用性明显优于经典的遗传操作方法.     

酿酒酵母线粒体蛋白转运系统在立克次体中的同源分析

进化分析表明,与线粒体亲缘关系最近的原核生物是立克次体(Rickettsia prowazekii).搜索酿酒酵母(Saccharom ycescerevisia)线粒体蛋白转运系统的35个亚基在立克次体中的同源蛋白质,仅发现了5个同源蛋白,且它们只属于转运系统在线粒体外膜和基质上的模块,没有发现转运系统在膜间隙和内膜...     

多波形超声波辐照对啤酒酵母细胞生长的影响

研究了四种波形的超声波对啤酒酵母细胞生长的影响。在细胞生长的调整期进行超声辐照时,各种处理对细胞生长都有不同程度的促进作用,其中第三波形的效果最好,在对数生长期进行处理时,对细胞生长有抑制作用,且前期处理效果最发的波形对后期的抑制作用也最明显,在平衡期进行处理,对细胞生长没有明显影响。     

两段发酵法培养重组酿酒酵母生产乙肝表面抗原

通过具有选择性压力合成培养基的使用和大豆蛋白胨的补加,建立了两段法重组酿酒酵母表达乙肝表面抗原的发酵生产工艺,使总的抗原表达量比原始批培养提高了25%,单位菌体抗原表达量提高了68%。对合成培养基和过程进行了优化,降低了生产成本,使两段发酵法更适合于实际生产。通过测定发酵过程中质粒的稳定性,证明抗原产量的提高是由于质粒稳定性提高所致。     

啤酒酵母菌对汞离子(Ⅱ)的生物吸附

对啤酒酵母菌与水相中重金属离子Hg2+的生物吸附情况进行了研究·主要研究了溶液的pH值、吸附时间、菌体用量、Hg2+离子的初始质量浓度、温度等因素对生物吸附效果的影响·试验结果表明:啤酒酵母对水相中的Hg2+具有良好的吸附效果,在pH=3、吸附时间为15min时,对质量浓度为2 6g/L的Hg2+溶液进行吸附,去除率可达96%·啤酒酵母菌对Hg2+的吸附是一个快速过程,在15min时吸附效果最佳,之后有解吸现象的存在·pH值对Hg2+的吸附影响很大,在pH=3～5时吸附效果较好·温度对该吸附效果影响不大,室温下操作即可·     

人白介素-6表达质粒的构建及在酿酒酵母中的表达

将带有哺乳动物细胞信号肽的人白细胞介素-6(hIL-6)基因片段构建到大肠杆茵-酵母细胞穿梭型质粒pYES2中，获得表达质粒pYES2-hIL-6。另外，将表达质粒pYES2-hIL-6转化到酿酒酵母细胞DBY747中，并将获得的转化子在含2％乳糖的YP培养基中培养到OD600=1．0左右，后用2％的半乳糖进行了诱导表达。结果发现，在培养上清中发现人白介素-6的分泌。     

离子液体[Bmim]Cl对酿酒酵母AY92022生长的影响

考察了不同浓度的离子液体对酿酒酵母AY92022（Saccharomyces cerevisiae AY92022）生长的影响,以在不合氯化1-丁基,3甲基咪唑的土豆培养基中生长的酿酒酵母AY92022为对照组。结果发现,当[Bmim]Cl的浓度低于10^-6g／L时,酵母菌生长受到的影响较小。随着离子液体浓度的增大,酵母菌生长受到的影响逐步增大,当[Bmkn]Cl的浓度为10-^-3g／L时,其稳定生长期的菌体浓度为0．0101g／mL,为对照组的63．5％;葡萄糖浓度为1．59％时,为对照组的2．41倍;乙醇浓度为4．83g／L时,为对照组的61．4％。     

啤酒酵母菌对Pb2+与Zn2+的生物吸附规律

研究了啤酒酵母菌体对工业废水中重金属离子Pb2 ,Zn2 的生物吸附规律.实验结果表明,啤酒酵母菌体对Pb2 的吸附效果比对Zn2 的吸附效果要好;啤酒酵母菌体对铅离子和锌离子的吸附作用与pH值密切相关,最佳的pH值范围均是4～6.体系pH=4时,啤酒酵母菌对Pb2 的吸附量最大,为98.20mg/g;在pH=5.5时,啤酒酵母菌对Zn2 的吸附量最大,为13.89mg/g.在初始铅、锌离子浓度均为1mmol/L的水溶液中,吸附时间为15min即达到吸附平衡,该吸附过程具有一级动力学反应特征.     

啤酒酵母菌对Pb~(2+) 与Zn~(2+) 的生物吸附规律

研究了啤酒酵母菌体对工业废水中重金属离子Pb2+,Zn2+的生物吸附规律·实验结果表明,啤酒酵母菌体对Pb2+的吸附效果比对Zn2+的吸附效果要好;啤酒酵母菌体对铅离子和锌离子的吸附作用与pH值密切相关,最佳的pH值范围均是4～6·体系pH=4时,啤酒酵母菌对Pb2+的吸附量最大,为98 20mg/g;在pH=5 5时,啤酒酵母菌对Zn2+的吸附量最大,为13.89mg/g·在初始铅、锌离子浓度均为1mmol/L的水溶液中,吸附时间为15min即达到吸附平衡,该吸附过程具有一级动力学反应特征·     

木糖发酵重组酿酒酵母研究进展

近年来针对木质纤维素类原料生物转化乙醇的研究引起了广泛关注。乙醇的高产依赖于木质纤维素水解液中六碳糖和五碳糖的共同发酵。但是,传统产乙醇酵母酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 既不能发酵木糖, 也不能利用该五碳糖生长。因此, 研究人员尝试各种方法构建重组酵母菌以提高木糖发酵能力。作者综述了木糖发酵重组酿酒酵母菌的研究进展,包括天然木糖发酵微生物、木糖代谢途径、S. cerevisiae 的代谢工程、原生质体融合以及基因组改组技术, 同时也对目前研究存在的问题及研究前景进行了讨论。     

携带p53基因重组腺病毒载体的构建

将pCMVp53重组转移载体经BamHI和NheI酶切,得到p53基因cDNA,然后将cDNA片段克隆到转移载体pCMV5GFP,使其受CMV5启动子的调控,获得pCMV5p53重组转移载体.用该线状重组转移载体与腺病毒右臂DNA经磷酸钙共转染293细胞获得重组腺病毒,经酶联免疫吸附法(ELISA)测定p53蛋白含量,证明外源p53基因在含重组腺病毒的293细胞中得到表达.