烟草腺毛全长cDNA文库的构建

冻刷法收集烟草品种K326腺毛组织,Trizol法提取总RNA,采用SMART技术构建了烟草腺毛的全长cDNA文库.经鉴定表明,文库滴度为1.01×106pfu/mL,重组率为99.5%.随机选择24个阳性克隆进行插入片段测序,结果显示,插入片段长度在800~1 000 bp之间,将测得的序列进行Unigene归并和序列全长分析,得到了23条Unigene,21条序列有相关同源信息,其中14条为全长,完整性比率达到66.7%.结果表明,文库质量较好,可用于下一步基因克隆及基因表达谱的研究.     

海鲈头肾cDNA文库的构建

本文以海鲈头肾组织为材料,分离出mRNA,合成cDNA双链后,收集500-4000bpcDNA片段,构建了λZAP表达型cDNA文库。初级文库的滴度为7×105pfu,随机挑选噬菌斑的插入片断在500~2000bp之间,证明建立的文库中所包含的重组cDNA分子种类具有一定的完整性,可作为海鲈头肾基因的重要资源。     

棉铃虫雌性成虫脂肪体cDNA文库的构建

用异硫氰酸胍 酚 氯仿 步法从棉铃虫雌性成虫脂肪体中提取总RNA ,经过Oligo(dT)纤维柱分离出mRNA .以mRNA为模板 ,Oligo(dT)为引物 ,在逆转录酶催化下合成单链cDNA(sscDNA) .然后在E .coliDNA聚合酶Ⅰ与RNaseH共同作用下 ,进一步合成双链cDNA(dscDNA) .平末端dscDNA与EcoRI/NotI接头连接 ,插入λgt11表达载体 ,经体外包装后转染Y10 90 r 宿主菌 ,构建成棉铃虫脂肪体cDNA文库 .该文库的滴度为 3.5× 10 5pfu/mL ,重组率为 10 0 % ,该文库适合于筛选低丰度mRNA的cDNA克隆 .     

杨树黑斑病感抗无性系cDNA文库的构建

为了分离与抗病相关的目的基因,以病原菌接种后对黑斑病具免疫力的美洲黑杨I 69及黑斑病的高感无性系欧美杨I 45的叶片为材料,在利用荧光差异显示反转录聚合酶链式反应(DDRT PCR)获得抗病相关cDNA片段的基础上,用试剂盒及同样的植物材料构建了两个cDNA文库L45 72及L69 72。两文库的滴度分别为3.44×109pfu/mL及3.94×109pfu/mL,大于500bp的片段分别占96.67%和73.33%。     

中国美利奴羊外周免疫器官cDNA文库的构建及鉴定

为了筛选中国美利奴羊与免疫反应相关的的功能基因并研究这些基因的功能,构建了以美利奴羊外周免疫器官的cDNA文库。通过提取总RNA,分离纯化mRNA并以其为模版参照ZAP Express cDNA Synthesis Kit说明书构建cDNA文库。结果表明:该文库初级库容达到了3.28×105pfu,扩增库滴度为3.8×108pfu/mL,重组率为97.7%。插入片段介于0.5至2.3 kb之间,平均大小为1.5 kb。该文库的成功构建为后续研究奠定了分子基础。     

中国家蚕抗菌肽A基因片段的初步分离

从中国家蚕蛹中提取基因组ＤＮＡ，根据中国家蚕抗菌肽Ａ的ｃＤＮＡ序列设计引物，从基因组ＤＮＡ中扩增天然抗菌肽基因，得到７５０ｂｐ，１１００ｂｐ，１６００ｂｐ左右的３个片段，用内引物扩增法，初步证实中国家蚕抗菌肽Ａ基因至少存在７５０ｂｐ，１１００ｂｐ左右大小的两个拷贝。     

家蚕抗菌蛋白Cecropin D和Lysozyme的分离纯化及性质鉴定

经大肠杆菌E．coli K12D31诱导后的家蚕幼虫，其免疫血淋巴经CM-Sepharose CL-6B离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤层析及HPLC分离后，得到2种抗菌蛋白，经液相色谱-电喷雾质谱（ESI-MS）分析鉴定，纯化的2种抗菌蛋白分别是家蚕抗菌肽eeeropin D和溶菌酶lysozyme酸性电泳（A-PAGE）测活免疫血淋巴得到抗菌蛋白活性谱：cecropin D在8h无显著表达，12h有较强抗菌活性，30h达到最高，以后逐渐降低；lysozyme在8h后检测到表达，12h到达高峰，之后逐渐下降，48h的血淋巴中未检测到明显的表达．研究认为抗菌蛋白lysozyme和cecropin D是家蚕幼虫感染细菌8h后大量表达的抗菌蛋白，主要参与细菌感染12～30h的血淋巴对细菌的清除，是参与家蚕幼虫抗菌免疫的重要蛋白．     

应用核型多角体病毒载体在家蚕和家蚕培养细胞中高效表达人尿激酶原cDNA基因

将人尿激酶原(pro-UK)cDNA分别插入家蚕核型多角体病毒转移载体pBK283和pBF4中,构建成两个重组质粒。所构建的这两个重组质粒与野生型家蚕核型多角体病毒DNA(BmNPV genomic DNA)共转染家蚕培养细胞,经病毒斑实验(Plaque assay)筛选出含pro-UK cDNA的稳定重组病毒株BmNPV-pk1和BmNPV-pk2。将此两株重组病毒分别感染家蚕培养细胞和家蚕幼虫4天后,用酶联免疫测定法(ELISA),纤维蛋白平板溶圈测活法和Western印迹法分析细胞培养上清及细胞和家蚕的体液及组织,证实均有pro-UK表达。家蚕培养细胞的表达量分别为0.0012mg/mL(上清液和10~6细胞)和0.0031mg/mL(上清液和10~6细胞),家蚕幼虫体液的表达量分别为0.0100mg/mL和0.0300mg/mL。从以上结果可看出,家蚕幼虫体液的表达量是培养细胞的10倍,以上表达产物在纤维蛋白平板上测活均有溶纤活性。     

忽地笑(Lycoris aurea)叶片cDNA文库的构建与分析

用表达型噬菌体载体ZAP构建了忽地笑叶片cDNA文库。文库宿主菌为E.coliXL1 BLUE,亚克隆空菌为E.coliXLOLR。初始文库的滴度为5.6×105pfu/mL,扩增文库的滴度为6.9×109pfu/mL,含插入片段的频率为96%,插入片段大小在0.5～2.5kb,文库质量良好。为进一步从基因组学和分子生物学方面研究忽地笑叶片发育及克隆相关全长基因奠定了基础。     

水稻全长均一化cDNA文库构建及SDG725结合蛋白筛选

为了筛选水稻组蛋白甲基转移酶SDG725的结合蛋白,构建了水稻全长均一化cDNA文库,以SDG725C末端为诱饵蛋白对cDNA文库进行筛选.最后筛选到70个可能与SDG725相互作用的蛋白,同时对筛选出的候选蛋白进行GO功能分析和亚细胞定位预测,并对部分蛋白与蛋白相互作用进行了验证.研究结果发现筛选到的结合蛋白有17%位于细胞核中,更多位于核外,为进一步研究SDG725的生物学功能提供理论基础.     

石斑鱼卵巢cDNA文库构建及脂肪酸结合蛋白克隆

应用SMARPTM技术构建了斜带石斑鱼Epinephelus coioides卵巢cDNA文库。所构建的cDNA文库滴度为4.5×106 pfu/mL,重组率为99％,扩增后文库的滴度为1.2×1010pfu/mL。把phagemid转化为质粒后,随机挑选60个阳性克隆进行酶切鉴定和测序。酶切结果表明:插入片段长度均在500~3 000 bp之间。测序结果经过生物信息学分析,发现其中一个克隆为脂肪酸结合蛋白(FABP)基因全长,并与人肝型(L)脂肪酸结合蛋白同源性最高,为70％。     

平颏海蛇毒腺cDNA表达文库的构建

以直接表达载体质粒pc DNA3为载体,成功构建了一个高质量的平颏海蛇毒腺cDNA表达文库,这是国内首个海蛇cDNA文库,通过对亚文库克隆的大规模序列测定和分析,发现了38个海蛇新基因序列,其中包括神经毒素基因,磷酸脂酶A2基因和半胱氨酸丰富毒蛋白基因共10个编码海蛇毒素蛋白的新基因。