红酵母苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及性质研究

采用玻珠破壁 ,硫酸铵分级沉淀 ,凝胶过滤和离子交换等方法 ,从L 苯丙氨酸工业生产菌株红酵母中分离纯化苯丙氨酸解氨酶 (PAL) ,纯化倍数为 1 39,收率为 1 2 6%,纯化到的酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳均为单一蛋白带 ,其亚基分子量约为79.4kD该酶最适反应温度为 40℃ ,最适反应pH为 8.5 ,以L Phe为底物 ,40℃ ,pH 8.5的Km值为 3 87× 1 0 - 4 mol/L 除了Mg2 +和Na+,其它金属离子如Fe3+,Cu2 +,Co2 +,Hg2 +等对其都有明显的抑制作用 .     

5种中药材中苯丙氨酸解氨酶(PAL)的生物信息学分析

中药材作为中药生产的原材料,其质量直接影响中药的品质.苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonialyase,PAL)对植物木质化、根瘤的形成、抗逆境、抗虫以及抗病等方面具有重要作用,特别是参与植物次生代谢,而中药材品质的高低主要体现在次生代谢产物含量的高低.因此,为了充分认识中药材中PAL的特点,本文选取了蒙古黄芪、刺槐、蓖麻、毛花洋地黄、胡黄连5种中药材作为研究对象,模式植物拟南芥为参考对象,运用在线工具及生物信息软件对这5种中药材及拟南芥的PAL基因编码序列进行分析,分析其核酸与蛋白的理化性质,结构特点以及之间的同源性.结果显示,5种中药材及拟南芥PAL基因序列长度在2 100～2 600bp之间,G+C含量为41%～49%,编码713～725个氨基酸.蛋白分子量最大的是拟南芥,为78.73kD;最小的是胡黄连,为77.67kD.PAL的酶切位点、糖基化位点、磷酸化位点在不同中药材中也各有异同;二级结构以螺旋和环为主,均由4个亚基组成了其三级结构.以上结果表明,5种中药材的PAL具有一定的同源性,其在进化过程中具有一定的保守性,核酸蛋白理化性质及二级结构有差异,但差异不大.在此基础上可进一步深入研究PAL在5种中药材苯丙烷代谢中对次生代谢物的调控机理,有目地地调节中药材中PAL的表达及活性,从而提高中药材品质.     

刺槐幼苗中苯丙氨酸解氨酶的活力

<正>刺槐种子吸胀1h后,就显示出苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活力,随着刺槐幼苗的长大,PAL活性不断增强。30d苗龄的刺槐幼苗不同组织的PAL活力差别很大,以幼茎为最高,幼叶次之,幼根最低。PAL活力与刺槐胚轴或幼茎的维管系统即导管分子的数量和木质化程度增长趋势相一致。它可能对提高树苗品质、抗病虫能力有积极意义。     

油茶苯丙氨酸解氨酶基因的cDNA克隆与序列分析

苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)是苯丙烷类代谢途径的关键酶之一。以油茶(Camellia oleifera)近成熟种子cDNA文库和EST文库为材料,通过分子克隆方法鉴定了PAL全长cDNA。结果表明：油茶PAL基因的cDNA长2 118 bp,编码705个氨基酸,与其他物种的PAL具有较高的相似性,在进化上高度同源;油茶PAL编码的蛋白质序列包含与水稻、玉米PAL蛋白质相同的脱氨基位点和催化活性位点;PAL系统进化树表明, 油茶PAL基因与灌木类植物的PAL基因聚类关系最近。     

玉米苗苯丙氨酸解氨酶活性周期性变化的研究

本文研究了光和黑暗对玉米苗 L—PAL 活性的影响。光对该酶活性具有促进和其后抑制的双重作用。连续光照下酶活性呈现周期性变化,但不是一种內生节奏,因为在连续黑暗期间酶活性保持在一定的水平上.     

氨基酸序列分析揭示苯丙氨酸/酪氨酸解氨酶在陆生植物中的演化

苯丙烷途径在陆生植物木质素和黄酮类等次生代谢产物的生物合成中至关重要，其中一步必需的反应为苯丙氨酸解氨酶(PAL)将底物苯丙氨酸脱氨催化为下游产物。最新研究发现了能够同时催化苯丙氨酸和酪氨酸脱氨的双功能酶—苯丙氨酸/酪氨酸解氨酶(PTAL),但是对诸多问题，例如怎样精准鉴定PAL和PTAL、植物PAL演化为PTAL其氨基酸序列发生了什么变异、哪些植物类群包含PTAL等，仍属未知。为了探索PAL基因家族在陆生植物中的演化及关键变异，本研究利用PAL氨基酸全长序列构建了陆生植物不同类群系统发育树，比较和分析了PAL和PTAL氨基酸序列并模拟了其蛋白质三维构象。结果表明，以PAL氨基酸序列构建的系统发育树，能够反映已知陆生植物的系统关系，PAL和PTAL的氨基酸序列中存在着8个差异位点，其中121和123这两个关键位点非常稳定，可以联合用于准确鉴定包含PAL和PTAL的植物，并且I121L和F123H的关键变异，导致只能与苯丙氨酸结合的PAL演化为也能同时结合酪氨酸的PTAL。     

苯丙氨酸解氨酶印迹交联酶聚体的制备及部分催化性能研究

苯丙氨酸解氨酶(PAL)是酶法生产L-苯丙氨酸的关键酶,目前主要利用红酵母PAL进行转化,但红酵母PAL稳定性较差,妨碍了其工业化的应用。该研究将交联酶聚体和印迹酶的制备方法相结合,制备出新型固定化酶-苯丙氨酸解氨酶印迹交联酶聚体,筛选出最优的底物印迹分子,并考察了该固定化酶的部分特性。结果表明,反式肉桂酸是制备印迹PAL交联酶聚体的最适底物,所制备印迹交联酶聚体的最适催化温度和pH值分别是50℃和10.5,并表现出较好的重复使用性,连续催化9个批次后,仍保持了32%的酶活保留率。     

光照对玉米苯丙氨酸解氨酶活性的影响

在自然光照下玉米叶片内PAL活性呈周期性变化，光一方面可以启动和激活PAL活性，另一方面可以促进PAL-I的合成，使PAL活性达到一定峰值后开始下降，在连续光照下，光对PAL活性也同样具有双重影响，使PAL活性产生24h循环节奏波动、在连续黑暗中PAL活性表现较稳定的低水平。     

低温对植物幼苗L—苯丙氨酸解氨酶活性的影响

本文研究了在黑喑下植物幼苗叶片 PAL 活性对低温的反应.低温(6-8℃)处理对酶活性具有促进效应.氯霉素或5—氟尿嘧啶也促使 PAL 活性显著增加.低温下玉米幼苗离体叶片切段 PAL活性的增高可能是由于原有酶的激活或抑制物活性的下降低于其合成活动的下降,而并非酶重新合成速度的增加.     

营养胁迫下3种杀虫剂对小麦苯丙氨酸解氨酶活性的影响

 营养胁迫及农药胁迫等逆境在农业田间生产中十分常见.为明确不同营养胁迫条件下,常用杀虫剂使用对小麦苯丙氨酸解氨酶(PAL)的影响,研究了3种质量浓度的吡虫啉、灭多威、氧乐果分别处理清水及营养液中培养的小麦苗后5d内,对小麦苗苯丙氨酸解氨酶活性的影响.结果表明,35mg/L吡虫啉处理营养液组及清水组小麦苗后6h时,小麦苗PAL均受到抑制,活性显著降低;在处理后12h时,营养液组小麦PAL活性与对照相比,显著升高了37.8%,而清水培养的小麦苗PAL未出现显著升高;100,200,400mg/L灭多威处理对2组小麦苗中PAL活性的影响与吡虫啉处理类似.氧乐果处理后6h,营养液组小麦苗PAL活性比对照显著升高了107.8%,在处理后24h时,营养液组小麦PAL活性又显著降低,而后变化不再显著;而清水组小麦苗PAL活性在氧乐果处理后12h及48h时,活性显著降低,在处理后5d内,均无显著升高阶段.可见,杀虫剂对小麦苗中PAL活性的影响与药剂本身的性质有关,还具有一定的剂量效应与时间效应.营养状况对小麦苗的PAL防御响应也会产生一定的影响.清水培养组小麦与营养液培养组小麦相比,在药剂胁迫下,PAL活性在营养物质充足条件下的防御响应更为显著,并迅速恢复为不受影响的正常状态.     

粘红酵母产L-苯丙氨酸解氨酶的研究

对粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)产生L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)的产酶条件进行了研究.结果表明粘红酵母产酶最佳条件为培养基／g*L－1;葡萄糖5．0,豆饼水解液10．0(以氨基酸计),KH2PO40．5,Ph5．5;接种量5%,摇瓶转速170r／min,28℃培养15h后添加L-苯丙氨酸至终质量浓度0．5g·     

接骨草蔗糖酶同工酶的分离纯化及其部分性质研究

从接骨草幼叶中提取的蔗糖酶粗酶液经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析纯化，得到3种同工酶．对3种同工酶进行SDS-PAGE和IEF电泳均显示一条蛋白带，其亚基分子量分别为45．8KD，44．3KD，43．2KD；等电点分别为pH4．0，pH3．8，pH3．75．凝胶过滤测得3种同工酶全酶分子量分别为91．2KD，89．1KD，87．4KD，表明3种同工酶均由2个相同亚基组成，其表观Km分别为30mmol／L，57.1mmol／L，65mmol／L;Vmax分别为98μg／min，48μg／min，35μg／min．同工酶Ⅰ和同工酶Ⅲ在pH4．4～5．0时有最大活性，同工酶Ⅱ则在pH3．9～4．2时有最大活性．3种同工酶均在pH3-6范围内比较稳定．同工酶Ⅰ和同工酶Ⅱ在48～52℃有最大活性，同工酶Ⅲ在50～55℃有最大活性．3种同工酶均在50℃以下有较好的稳定性．     

脉孢霉纤溶酶的酶学性质研究

研究了脉孢霉纤溶酶的部分酶学性质,确定该酶由双亚基组成,亚基分子量分别为30000Da、15500Da,等电点为7.9±0.2,最适作用pH值为7.4,最适作用温度为50℃,在pH6.6～9和32～42℃时较稳定。     

芦荟超氧化物歧化酶的纯化与部分性质

芦荟粗提取液经丙酮沉淀、热处理、DEAE-琼脂糖柱层析和Sephacryl S-200凝胶过滤纯化后得到3种电泳纯的SOD组分,即SOD-Ⅰ、SOD-Ⅱ、SOD-Ⅲ.分子量分别为46000D,35000D,40000D;亚基分子量分别为23000D,17000D,20 000D,说明芦荟SOD三种组分均为二具体,其等电点分别为8.90,7.60,7.35。抑制剂敏感性实验和元素分析结果表明3种芦荟SOD组分均为Fe-SOD.     

玉米螟谷胱甘肽转硫酶的纯化及性质研究

以亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)为材料,经Sephadex-G75、DEAE-Sepharose Fast Flow、还原型谷胱甘肽(GSH)为配基的亲和层析,分离纯化得到玉米螟谷胱甘肽转硫酶(GST)。以2,4-二硝基氯苯(CDNB)为底物测得其比活为1070U/mg蛋白,收率为22.9%,提纯1138倍。经SDS-PAGE和PAGE鉴定,得到的GST为一条带,亚基的分子量为25kD,经凝胶过滤测得其全酶分子量为50kD,说明该酶是由两个相同亚基组成的。IEF测得主带等电点为8.2。该酶最适温度为41℃,最适pH范围为6.3～6.9。经动力学测定该酶双底物反应机制为序列机制,对CDNB的K_m值为0.15mmol/L,对GSH的K_m值为0.35mmol/L,两种底物的k_cat均为783s^-1。Cl-对底物CDNB有竞争性抑制作用,对GSH是非竞争性抑制作用;3,5-二硝基苯甲酸(DNB)对CDNB有竞争性抑制作用,对GSH是反竞争性抑制作用。     

苦瓜籽中抗真菌蛋白MAP13的分离纯化与表征

将苦瓜籽粗提液分别经阴离子色谱柱、阳离子色谱柱交换后,得到一个具有抗真菌活性的蛋白MAP13.该蛋白经鉴定达到电泳纯,相对分子量为12.7 kDa.经还原剂处理后,电泳结果表明该蛋白由分子量分别为7和6 kDa的两个亚基组成,亚基之间通过二硫键连接.体外抑菌实验表明该蛋白对苹果轮纹病菌、瓜果腐霉病菌和棉花枯萎病菌具有较强的抑制作用.     

毛果杨苯丙氨酸解氨酶活性比较及肉桂酸制备

【目的】苯丙氨酸解氨酶(PAL)在苯丙烷代谢途径中具有重要作用,PtrPAL基因的挖掘、酶学性质分析和应用为毛果杨苯丙烷代谢途径的研究和肉桂酸(t-ca)合成提供参考。【方法】基于基因组注释信息,挖掘毛果杨PtrPAL基因,进行原核表达和酶学性质分析。以L-苯丙氨酸(L-Phe)为底物,通过全细胞催化合成t-ca。【结果】通过挖掘毛果杨基因组得到了5个PtrPAL基因,系统发育树分析表明其在进化上分为两组。PtrPAL3和PtrPAL4来自不同进化分支,选取其进行原核表达和酶学性质分析。镍柱纯化后的重组蛋白rePtrPAL3和rePtrPAL4最适温度分别是55 ℃和60 ℃,最适pH分别是8.5和8.0,比酶活分别为3.363和3.381 U/mg,且均具有微弱的酪氨酸解氨酶活力。重组蛋白的动力学分析表明,rePtrPAL3对L-Phe的亲和力更高。将rePtrPAL3应用于L-Phe脱氨生产t-ca,全细胞催化7 h可产生104 mmol/L t-ca。【结论】具有不同转录特异性的两种rePtrPAL酶学性质接近,但rePtrPAL3表现出更高的催化效率,更适合用于t-ca的生物合成。而且,其产量高于文献报道的28 mmol/L水平,具有良好的应用潜力。     

北京鸭红细胞超氧化物歧化酶—分离纯化和性质

采用氯仿—乙醇分级分离,丙酮沉淀以及DE-32纤维素柱层析的方法,从北京鸭红细胞中分离得到纯的铜锌超氧化物歧化酶(Cu·Zn-SOD)。4升鸭血红细胞的SOD制品总活力为375,400u,比活力为13,410u/mg蛋白,回收率为64％。 铜锌超氧化物歧化酶制品呈淡蓝绿色,最大紫外吸收波长为258nm。测得该酶分子量为32,000,亚基分子量为16,000。该酶亚基由150个氨基酸残基组成,不含色氨酸,并测得它的N—末端氨基酸为丙氨酸。     

鼠肾纤维蛋白溶酶原激活酶的纯化和部分鉴定

采用肝素—Sepharose亲和层析和凝胶过滤自鼠肾提取纤维蛋白溶酶原激活酶,产率5.1×10~(-5)％。在还原和非还原状态下SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳及电泳酶谱分析均呈单一区带,证实产物仍保持单链状态。测得其分子量为70000。纤维平板试验和无纤维蛋白溶酶原纤维平板试验证实其活性依赖于纤维蛋白溶酶原。     

猪血浆巯基蛋白酶抑制剂的分离纯化及性质研究

用(NH_4)_2SO_4分段盐析,DEAE-纤维素离子交换和Papain—Sepharose亲和层析,从猪血浆纯化了一种巯基蛋白酶抑制剂(SUlfhydryl proteinase inhibitor;简称SPI);纯化倍数为54.36倍.经高pH、低PH不连续电泳呈一条区带.含糖量为7.77％;PI为4.80.氨基酸组成分析表明,猪血SPI富含酸性氨基酸、芳香族氨基酸和含硫氨基酸.用SDS-PAGE和SephadexG-100层析,测得分子量为130000d和131000d,由两个分子量略有差别的亚基组成.对木瓜蛋白酶有强烈抑制作用,对胰蛋白酶无作用。α-螺旋结构含量高。