3个杂交水稻亲本成熟期种子内生细菌多样性研究

通过传统微生物培养方法,对成熟期的杂交水稻亲本“深08S”、“和620S”及“16A007”种子内生细菌群落结构多样性进行分析。实验表明,处于成熟期的杂交水稻亲本种子内生细菌群落结构具有多样性。“深08S”种子内生细菌含40个分类操作单元(operational taxonomic units, OTU),分属Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria及Bacteroidetes类群,其中,第一优势菌属为Rhizobium,丰度为15.83%,第二优势菌属为Bacillus,第三优势菌属为Sphingomonas和Curtobacterium。“和620S”种子内生细菌含20个OTU,分属Firmicutes、Proteobacteria及Actinobacteria类群,其中,第一优势菌属为Curtobacterium,丰度为25.33%,第二和第三优势菌属分别为Microbacterium和Pantoea。“16A007”种子内生细菌含24个OTU,分属Firmicutes、Proteobacteria及Actinobacteria类群,其中,第一优势菌属为Pantoea,丰度为35.00%,第二优势菌属和第三优势菌属分别为Micrococcus和Pseudomonas。相比处于灌浆期的水稻种子内生细菌,成熟期的水稻种子内生细菌更丰富,种类更多。由研究可见,种子内生细菌的种类随种子成熟度而变化,成熟期的水稻种子具有丰富的内生菌资源,可为开发新的植物益生菌剂奠定基础,且水稻种子内生细菌的组成与水稻品种有一定的关系。     

利用PCR-DGGE技术分析微生态制剂在传代过程中的菌群变化

利用变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE）技术,结合传统平板培养法对实验室研制的1种由乳酸菌和芽孢杆菌组成的微生态菌剂WS-401及其在连续转接培养过程中细菌种群组成的动态变化进行分析。WS-401原液的活菌数为2×107 cfu/mL,且细胞个体形态多样。将分离自原液的3株细菌进行DGGE分析,出现2种指纹谱带,对照标准的DGGE指纹图谱库和序列分析,分别被鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）。将该菌剂分别在LB和MRS两种培养基中30℃或37℃连续转接5次,DGGE分析每次转接后培养物的菌群组成,结果发现,随着转接次数的增加,微生物菌群的种类减少,在LB培养基中转接5次后优势菌群只有蜡状芽胞杆菌,而在MRS培养基中转接后优势菌群为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和类干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）。由此说明,微生物的营养基质和培养条件对微生态制剂在传代过程中的菌群组成和动态变化有重要影响。     

茶树草螺菌WT00C-Se发酵制备红色纳米单质硒

茶树草螺菌是从野外茶树中分离的一种革兰氏阴性内生细菌。茶树内生草螺菌WT00C在含200 mmol/L硒酸钠的LB培养基内37℃培养28 h后,收获、保存细菌并重新命名为茶树草螺菌WT00C-Se。将茶树草螺菌WT00C-Se重新接种至含200 mmol/L硒酸钠的LB培养基中培养,其生长抑制期和生长期缩短6 h,仅为原来茶树内生草螺菌WT00C菌株的一半。摇瓶培养和电镜观察都表明茶树草螺菌WT00C-Se仍拥有还原硒酸盐、生成红色纳米单质硒(Se~0)的能力。根据茶树草螺菌WT00C-Se的特性,进行红色纳米单质硒产率条件优化后发现:首先用含75 mmol/L硒酸钠的培养基活化茶树草螺菌WT00C-Se,然后按1∶100比例接种200 mmol/L硒酸钠LB培养基,并在37℃、200 r/min、pH 7. 0条件下培养,红色纳米单质硒产率较高且耗时短。依照优化条件,使用发酵罐发酵30 h,每升培养物可制备出560 mg纯净的红色单质硒。该研究结果不仅为利用微生物生产红色单质硒提供了一种全新的思路,而且为今后产业化提供了强有力的技术支撑。     

桃杏果实内生细菌多样性分析及软腐病原菌的分离与验证

为了解桃和杏采后果实内生细菌群落组成,并对潜在病原细菌进行筛选与验证,为其贮藏保鲜、软腐病害防治等相关研究奠定基础,利用高通量测序技术,对新疆地产油桃和库车小白杏采后果实内生细菌群落组成进行分析;同时,利用微生物传统分离培养,采用16S rDNA序列分析对潜在病原细菌进行分子鉴定,并利用离体接种法和再分离法,对相关菌株的致病能力进行验证。研究结果表明,油桃和库车小白杏内生细菌共包括128个操作分类单元,涉及9个门117个属,其中变形杆菌门(Proteobacteria)为绝对优势菌门,其次为厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes);在属水平上,油桃以泛菌属(Pantoea)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、拟杆菌属(Bacteroides)等菌属为优势菌群;库车小白杏以葡糖杆菌属(Gluconobacter)、泛菌属(Pantoea)、克里斯滕森菌(Christensenella)、普氏菌属(Prevotella)等菌属为优势菌群。通过分离筛选获得了1株潜在采后致腐病原细菌XAAS-P1,经分子鉴定初步确定其归属于泛菌属(Pantoea)。XAAS-P1对采后油桃和库车小白杏均具有较强的致腐能力,并呈现出与自然软腐一致的病状。接种4d后,XAAS-P1致腐率可达100%,与阴性对照组相比,接种组样品的软腐现象提前了1d。对接种组病灶中的微生物进行再分离、鉴定,结果显示,菌株XAAS-P1是病灶组织中的绝对优势菌群,证明了菌株XAAS-P1是导致采后油桃和库车小白杏软腐变质的主要病原细菌。研究表明,桃和杏果实中存在丰富多样的内生细菌,其内生泛菌XAAS-P1可导致采后油桃和库车小白杏的软腐变质。     

西沙野生诺尼内生细菌群落多样性初步研究

采用构建16S rDNA克隆文库方法,首次对我国海南永兴岛西沙野生诺尼果内生细菌的群落结构和多样性进行初步研究.首次采用Mothur软件对诺尼果内生细菌克隆文库数据进行分析,构建Mothur软件数据分析平台.构建的西沙野生诺尼果内生细菌16S rDNA克隆文库中,93个克隆分属于12个不同可操作分类单元(operational taxonomic units,OTU),序列比对结果表明大部分克隆与已知细菌16S rDNA序列相似性较高.分别属于变形菌门(Proteobacteria)的Alpha、Beta、Gamma亚群,放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes).水库杆菌属(Piscinibacter sp.)细菌为野生诺尼果内生细菌优势菌群.优势菌属分别为水库杆菌属(Piscinibacter sp.)为80.65%,蛋白胨菌属(Peptoniphilus sp.)和链球菌属(Streptococcus sp.)均为3.23%,甲基杆菌属(Methylobacterium sp.)为2.15%.研究结果表明西沙野生诺尼果中存在较为丰富的内生细菌资源,将为进一步研究奠定理论基础.     

西沙野生诺尼叶片内生菌的分离与初步鉴定

主要研究西沙群岛野生诺尼叶片中可培养内生菌的多样性。利用常规平板分离方法进行菌株分离。通过测定真菌核糖体基因翻译间隔序列(ITS序列)和细菌16S r DNA基因序列,结合系统发育研究对所分离菌株进行鉴定分析。共分离到32株内生菌,分为19种。其中2种霉菌,共2株,分别属于炭层菌属(Nemania sp.)和毛壳菌属(Chaetomium sp.);细菌17种,共30株,分别属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、土地芽孢杆菌属(Terribacillus sp.)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)等7个已知属,其中芽孢杆菌属(Bacillus sp.)为绝对优势属,共20株,11种。     

哈密瓜内生细菌的分离及拮抗菌的筛选

对新疆不同品种和不同种植地区的健康哈密瓜植株组织中内生细菌进行分离,共得到252个菌株.经鉴定分属于芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、黄单胞菌属(Xanthomonas spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、欧文氏菌属(Erwinia spp.)、葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)及短小杆菌属(Curtobacterium),其中芽孢杆菌为优势种群.对内生细菌数量测定表明,不同品种、组织及种植地,内生细菌的数量不同,品种间内生细菌的数量变化为3.15×103～2.01×105CFU/g鲜重;各组织中以种子中最多,平均含量在6.18×106CFU/g鲜重;其次为根,再次为叶片,茎和叶柄中较少;对分离菌株进行哈密瓜叶斑病和果斑病菌拮抗菌的筛选表明,252株内生细菌中有71个菌株对叶斑病菌有拮抗作用,占菌株总数的28.2%,抑菌圈半径最大的可达8mm;6.7%的菌株对果斑病菌有拮抗作用.     

柑桔黄龙病病原——类细菌(Bacterium—like organism,BLO)的培养与性质

采用体外培养的方法首次从患柑桔黄龙病的柑桔树叶中分离并培养出柑桔黄龙病的病原——类细菌(BLO),测定了BLO最适培养条件及形状、大小和壁膜厚度.将培养出的BLO回接到指示植物长春花,2个月后长春花表现症状,且能重新培养出该BLO。健康柑桔树叶片及长春花均未培养出BLO。     

污水鱼池中的细菌动态及厌氧细菌的初步研究

本文对信阳师院生物系污水鱼池中的细菌数量、种类及群落组成的分析测定表明，污水鱼池中的细菌及群落组成是不断变化的，其优势菌为肠杆菌属．通过厌氧培养，将分离的厌氧细菌归属１１个属，其优势菌为革兰氏阴性无芽胞厌氧杆菌类．     

仁扇舟蛾幼虫肠道可培养细菌群落结构分析

【目的】了解仁扇舟蛾(Clostera restitura)肠道共生细菌的主要类群及其群落结构特征,明确仁扇舟蛾幼虫前、中和后肠可培养细菌的种类及群落结构组成,为进一步研究特异功能细菌的生理生化特征和功能提供基础。【方法】选取仁扇舟蛾5龄幼虫进行肠道解剖,分离前、中和后肠不同肠段,研磨稀释10^-1~10^-6,分别涂布于NA和LB固体培养基上,每个处理重复3次,28 ℃培养72 h。后对前、中和后肠可培养细菌进行分离纯化培养,提取细菌基因组DNA,利用 16S rDNA 基因序列分析和PCR扩增技术,获得细菌基因组序列,后与NCBI GenBank数据库进行Blast同源性比对,参考序列相似度98%以上近缘序列的物种信息,结合菌落形态特征和生理生化特性鉴定细菌种类,利用MEGA 7.0软件,采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统进化树。【结果】从仁扇舟蛾5龄幼虫的前、中和后肠中共分离获得22株可培养细菌,分属于变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria),共13个属,22个种。其中:假单胞菌属(Pseudomonas)4株,罗尔斯通菌属(Ralstonia)3株,芽孢杆菌属(Bacillus)3株,嗜麦芽寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)2株,气球菌属(Aerococcus)2株,其余微小杆菌属(Exiguobacterium)、微球菌属(Micrococcus)、短小杆菌属(Curtobacterium)、伯克氏菌属(Burkholderia)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、短状杆菌属(Brachybacterium)和两面神菌属(Janibacter)各1株。细菌的种类存在差异,前、中和后肠不同肠段的细菌种类分别为5、10和7种。3个肠段共有的细菌种类是皮氏罗尔斯菌(Ralstonia pickettii)和斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)。【结论】仁扇舟蛾5龄幼虫肠道的可培养细菌种类较为丰富,其中以变形菌门和厚壁菌门为优势菌群。不同肠段中可培养细菌的多样性和群落结构存在差异,其中以中肠可培养细菌种类较为丰富。此次从仁扇舟蛾肠道中分离到与单宁降解相关的细菌,分析表明仁扇舟蛾肠道菌群与宿主的取食习性有关,肠道细菌可能在克服植物次生代谢物质的化学防御上发挥作用。     

Illumina高通量测序分析百合内生真菌群落多样性

百合具有较高的药用食用价值,研究发现它的许多内生菌代谢产物有进一步开发利用的潜能,深入了解百合内生真菌群落结构与多样性,有助于发现新菌种以及具有特定功能的内生菌代谢产物。以ITS区的rDNA为靶标序列,采用Illumina MiSeq测序技术分别对百合叶片(bhy417)、百合茎秆(bhj417)和百合地下鳞茎(bhl417)三个样品的内生真菌群落结构组成和多样性进行测定分析。经过分析有以下结果:三个样品共得到用于后续样品分析的436394条有效序列和122205709个碱基;样品bhy417的内生真菌群落丰富度最大;三个样品之间的内生真菌群落多样性差异不显著、群落结构不同;球腔菌属Mycosphaerella、外囊菌属Taphrina、炭疽菌属Colletotrichum、散斑壳属Lophodermium、壳二孢属Ascochyta、Zymoseptoria属、Catenulostroma属、Phaeophleospora属、Endoconidiophora属、Hormonema属、乌氏霉属Uwebraunia、Capnobotrylla属、丛赤壳属Neonectria、长毛盘菌属Trichophaea等在样品中丰度较高。FUNGuild功能预测结果显示,百合内生真菌包括以下功能菌群:植物病原菌、动物病原菌、腐生菌、未定义腐生菌、内生菌、木材腐生菌、地衣寄生菌等。研究结果表明百合有丰富的内生真菌定殖,其中的植物病原菌以及一些目前还未鉴定出来的菌将可能对百合生防菌以及具特定功能代谢产物的研发提供帮助。     

熟制鲍鱼残留细菌的分离及16S rDNA鉴定

摘要：为控制熟制鲍鱼残留的细菌污染,采用平板划线分离技术对烘制加工后鲍鱼中残留的主要菌群进行分离,并通过菌落形态观察、革兰氏染色分析和16S rDNA序列比对等方法对其进行鉴定.结果表明,残留在烘制加工后鲍鱼的主要菌群有希瓦氏菌属、不动杆菌属、库特氏杆菌属、海洋类香菌、蜡样芽抱杆菌、肠杆菌属、彭氏变形杆菌等.     

重楼根内生细菌的多样性分析及促生菌的筛选

采集湖北地区代表性重楼种植园的重楼植株,并从0.1 g根中分离获得115株内生细菌. 16S rDNA序列分析结果表明,这些内生细菌归属于3个门、5个纲、7个目、11个科和12个属.其中,短食单胞菌属(Stenotrophomonas)为优势菌属(33.9%),而肠杆菌属(Enterobacteriaceae)、潘多拉菌属(Pandoraea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、短杆菌属(Brevibacterium)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、波氏菌属(Bosea)为劣势属.进一步通过与小麦幼苗共培养,筛选到4株促生菌,包括克雷伯氏菌属菌株HBR11019、假单胞菌属菌株HBR11015和HBR11017、芽孢杆菌属菌株HBR31040.其中HBR11019菌株的促生作用最强,与其共培养的小麦幼苗的株高、根长、鲜重、侧根数目分别是对照的2.6倍、2.1倍、5.7倍和1.0倍.本研究为深入分析不同产区重楼内生菌的差异以及利用促生菌改良重楼种植技术的研究奠定了基础.     

高效脱酚菌的筛选及微生物多样性分析

为了揭示不同培养基分离的细菌种群的多样性差异及获得高效脱酚菌,采用单链构象多态性技术,以16S rRNA基因的V3区为靶对象,对3种不同培养基SJ(自制培养基)、LB(牛肉膏蛋白胨培养基)、YEB(酵母牛肉膏培养基)分离细菌的种群多样性进行了比较研究.结果表明:SJ培养基比LB和YEB培养基有更高的种群多样性,更适于细菌的分离筛选.利用SJ培养基筛选出的3株高效脱酚菌降解废水中总酚的能力均在99%以上,经过生理生化鉴定和16S rDNA测序,建立了系统发育树,鉴定出这3株菌分别属于气单胞菌属(Aeromonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)和不动细菌属(Acinetobacter).     

基于高通量测序对四川怀远特色发酵食品微生物群落结构分析

为了研究四川怀远特色传统发酵食品的微生物多样性,利用Illumina HiSeq 2500高通量测序平台,对当地豆腐帘子和冻糕的微生物群落结构进行了系统分析.结果表明,豆腐帘子的菌群主要隶属于变形菌门(Proteobacteria)和担子菌门(Basidiomycota),检测出40个细菌属和21个真菌属,主要优势微生物是Acinetobacter和Trichosporon.冻糕的菌群主要隶属于厚壁菌门(Firmicutes)和子囊菌门(Ascomycota),检测出36个细菌属和23个真菌属,主要优势微生物是Lactobacillus和Kazachstania.     

特殊竹林土壤细菌群落结构及多样性研究

为对活竹酒生产区这种特殊环境中的竹林土壤细菌群落进行分析,研究其土壤微生物结构及其多样性,通过16S rDNA测序技术在IonS5TMXL测序平台上完成土壤细菌的高通量测序,对位于竹酒酿造区域的竹林核心区J1、非竹林区J2及竹林边缘区J3土壤进行了细菌群落结构分析。结果表明:样本细菌种类主要集中在酸杆菌门（Acidobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatinonadetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia）。其中,竹林核心区J1土壤细菌以放线菌门OTUs数占比最高,但其优势菌群为酸杆菌门酸栖热菌属（Acidothermus）;非竹林区J2以酸杆菌门占比最高,优势菌群为其下苔藓菌属（Bryobacter）;竹林边缘区J3处于竹林生境和非竹林生境的交汇地带, 生境不稳定,土壤细菌以变形菌门占比最高,优势菌属主要包括变形菌门鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、酸杆菌门苔藓菌属（Bryobacter）、芽单胞菌门金雀花属（Gemmatimonas）等,群落内物种较为复杂,但其细菌群落结构仍与竹林核心区J1相似。可见,随着样本从非竹林区逐渐接近竹林核心区,1）细菌群落多样性总体呈现先增加后降低的趋势,可能与竹林单一生境有关;2）个别细菌菌群数理和结构发生了较大变化,活竹酒酿造环境使得竹林土壤放线菌门而非变形菌门数量最多,或与当地独特的竹酒酿造环境相关。     

烤烟品种NC297内生细菌中拮抗烟草黑胫病的生防菌筛选及种群组成分析

 从来自烤烟品种NC297的970株内生细菌中,以烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var. nicotianae) 为靶标,共筛选出165株拮抗菌,这些内生细菌对黑胫病菌的抑菌率在9.55%~55.96%之间.内生细菌的生物量在苗期、团棵期、开花期和成熟期中无显著差异,但拮抗菌数量呈上升趋势.对165株拮抗菌的16S rRNA基因序列进行RFLP分析共产生12种带型.根据RFLP带型选取41株进行16S rRNA基因序列测定和系统发育分析.结果表明这165株生防内生细菌归于3大类群:Proteobacteria,Actinobacteria和Firmicutes.Firmicutes类群中的芽孢杆菌属(Bacillus)是优势属,共6种RFLP带型,159个菌株,包括Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum,Bacillus methylotrophicus,Bacillus tequilensis,Bacillus aryabhattai,Bacillus cereus和Bacillus mycoide.Bacillus amyloliquefaciens subsp.plantarum和Bacillus.methylotrophicus是Bacillus中分离频率最高的2种内生拮抗菌,共149株,占该属菌株数的90.30%.其余6个菌株分别属于6个种:Brevibacillus reuszeri,Streptomyces finlayi,Streptomyces atroolivaceus,Erwinia rhapontici,Enhydrobacter aerosaccus和Stenotrophomonas rhizophila.     

北京优质杂交玉米种子内生细菌种类多样性

通过传统微生物培养方法研究北京市自主培育并具有遗传相关性的优质杂交玉米种子内生细菌种类的多样性。实验表明来自共同父本京2416的杂交玉米京华8号、京农科728、京单68和NK718种子的内生细菌分别有10,14,13和18个OTUs;Microbacterium maritypicum DSM 12512T (AJ853910)是京农科728种子的第一优势种,是京单68种子的第二优势种,也是NK718种子的并列第三优势种;Microbacterium saperdae IFO 15038T(AB004719)是京农科728和京单68的并列第三优势种。来自共同父本京92的杂交玉米京科968和京科665种子的内生细菌分别有14和7个OTUs;京科968种子的第二优势种Bacillus horneckiae DSM 23495T(FR749913)也是京科665的第一优势种。结果表明玉米种子基因型对其内生细菌的种类多样性具有一定的影响,来自共同父本的杂交玉米内生菌在OTU数目上相近,并且具有相同的优势菌种;不同父本的玉米种子内生菌OTU数目不同,且内生菌群落结构也有所差异。这是首次以具有遗传相关性的北京优质玉米杂交种子为实验材料研究玉米种子内生细菌种类多样性与其基因型的关系。     

鲫鱼养殖池塘底泥菌群结构及常见可培养菌分析

为了研究江苏地区鲫鱼养殖池塘底泥细菌菌群结构与多样性,通过高通量测序技术对2017年8-10月间采集的江苏省不同区域养殖池塘底泥中所有细菌的16S rRNA V3-V4基因进行扩增测定,分析了底泥菌群结构特征;并通过平板计数法和选择培养基法检测池塘底泥中细菌总数和主要常见菌。结果表明,49个样品高通量测序共获得有效序列2152956条,可归为17735个分类操作单元(OTUs);物种注释结果显示,鲫鱼养殖池塘底泥中具有较高的菌群多样性,检测到的细菌归属于29个门类,所有池塘底泥都具有主要门类为变形菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、水生古细菌门、酸杆菌门、放线菌门、硝化螺旋菌门、螺旋菌门、芽单胞菌门、蓝细菌门、浮霉菌门、疣微菌门等。在属的水平上主要以硫杆菌属,乳酸球菌属,硫氧化菌,甲烷菌,地杆菌属,假单胞菌属,厌氧粘杆菌属,甲烷绳菌属,芽孢杆菌属等为主;所有池塘底泥共有菌主要有乳酸球菌属,甲烷菌,盐单胞菌,芽孢杆菌,红杆菌属,链球菌属,肉杆菌属,微小杆菌属,土芽孢杆菌属等。通过细菌培养发现,池塘底泥中常见益生菌如乳酸菌、芽孢菌具有较高的比例。可见鲫鱼养殖池塘底泥菌群结构及组成具有多样性,不同养殖池塘中共有的细菌可作为益生菌开发的参考菌株。     

石化污泥优势菌群的高通量分析及16S rRNA基因鉴定

针对石化污泥中的细菌进行了454高通量分析,共得到11 488条序列.发现在相似度97%的水平上,样品的OTU丰度最高;经测序分析,石化污泥中共有细菌235个属,其中短小盒菌属最多,占到整个细菌菌群的28.39%,芽孢杆菌属占14.43%,属种丰度1.5%～10.0%的有9个属(占28.99%).这11个属被确定为优势菌群.通过对污泥优势菌群的分离培养,依据16S r RNA基因鉴定该11属有22个种,并用16S r RNA基因序列比对建立了优势菌株系统发育树.该优势菌群能分解石化污水污泥中的工业污染物,并以此污染物为营养和能源,进行相对旺盛的生命活动,成为对石化污染水体进行生物修复的宝贵菌种资源.