家蚕抗菌肽CM4和人可溶性BAFF融合基因的克隆、表达及活性鉴定

采用PCR法从含有人可溶性BAFF基因的pET30a( )扩增得到人sBAFF基因,通过rPCR将抗菌肽Cecropin CM4基因的2条单核苷酸链进行扩增得到CM4基因,再采用over-lap PCR法通过linker将hsBAFF与Cecropin CM4融合基因相连接.经纯化和鉴定后,定向插入到原核表达载体pET30a( )中,然后转化E.coliBL21(DE3),通过实验确定了表达该融合基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为1.0 mmol/L,诱导时间为5 h.温度为30℃,其表达量占全菌蛋白的40%.表达产物经SDS-PAGE分析,得到相对分子质量约为22 000的重组蛋白并且存在超声裂解后的上清中.重组蛋白经Western blot检测,结果显示重组蛋白可被鼠抗人可溶性BAFF的抗体识别.采用分子筛Sephadex G-75对重组融合蛋白进行纯化,并经SDS-PAGE对其鉴定.通过对其生物学功能的检测得知,纯化后的重组融合蛋白对大肠杆菌K12D31和真菌有明显的抑菌能力.     

重组人血管内皮生长因子165在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化与体外活性评价

人血管内皮生长因子165(VEGF165)可有效促进血管新生和增加血管通透性,在伤口愈合方面有重要医疗价值。建立获取高纯度、高活性的优质重组VEGF165蛋白的方法具有重要意义。研究利用带有6组氨酸标签的二硫键形成蛋白A(Dsb A)的E.coli表达系统实现了Dsb A-VEGF165融合蛋白的可溶性表达;诱导过程中添加5%(v/v)的乙醇可显著提高工程菌中可溶性融合蛋白表达水平。融合蛋白通过Ni亲和层析粗纯,并经牛肠激酶酶切去除标签蛋白。随后利用肝素亲和层析精纯获得重组人VEGF165蛋白。非还原及还原SDS-PAGE电泳检测到分子量为约40 k Da的同源二聚体蛋白,促HUVEC细胞增殖实验显示重组蛋白具有较优的活性,EC50为13 ng/m L。研究实现了Dsb A-VEGF165的在E.coli中可溶性表达,建立了经济、高效的纯化方法,获得了高质量、高活性的重组人VEGF165蛋白。     

人annexin A2基因真核表达的构建及活性

为了构建人Annexin A2基因真核表达载体。通过TRIzol法提取Hela宫颈癌细胞中总RNA,采用RT-PCR技术(逆转录-聚合酶链反应)扩增Annexin A2的基因片段,并成功构建成VR1012-Annexin A2-HA重组质粒。经酶切、测序检测其构建的正确性,将质粒瞬时转染到293T人胚肾细胞,使用免疫荧光和蛋白印迹(Western blot)法检测基因表达,使用流式细胞术检测转染后细胞凋亡率。结果表明实验成功构建了具有表达活性的Annexin A2真核表达质粒,为进一步研究Annexin A2的抗凋亡作用奠定了基础。     

强化融合蛋白lhFⅦ-LDM对人肺腺癌细胞A549体内致瘤性的抑制

以人凝血因子Ⅶ(FⅦ)cDNA和编码力达霉素(LDM)辅基蛋白LDP的质粒(pETVH-LDP)为模板,通过PCR及搭桥PCR构建原核表达人凝血因子Ⅶ轻链(the light chain of FⅦ,lhFⅦ)和LDP融合蛋白lhFⅦ-LDP的重组质粒pET19b-lhFⅦ-LDP.重组质粒转化感受态表达菌株E.coli Rosetta-gami B(DE3)pLysS,诱导表达后亲和纯化,并以Western blot鉴定得到的融合蛋白lhFⅦ-LDP.将lhFⅦ-LDP与LDM的烯二炔发色团(AE)进行分子组装制备强化融合蛋白药物lhFⅦ-LDM.用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)检测lhFⅦ-LDP与人肺腺癌细胞A549组织因子(TF)的结合特异性,并通过裸鼠移植瘤实验研究lhFVⅡ-LDM对A549细胞体内致瘤性的影响.结果显示,lhFⅦ-LDP能够与TF特异性结合,并且,强化融合蛋白lhFⅦ-LDM能够显著抑制A549细胞的体内致瘤性.     

重组人胰岛素原在大肠杆菌中的可溶性表达

目前重组胰岛素主要用于糖尿病的治疗.通过大肠杆菌(E.coli)密码子优化,设计人胰岛素原基因,建立利用大肠杆菌表达可溶性重组胰岛素原的技术方法.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,重组质粒p His-Nus Ainsulin诱导表达的大肠杆菌可溶性表达融合蛋白His-Nus A-insulin.重组蛋白His-Nus A-insulin可溶性表达的最适条件为0.1,mmol/L IPTG作用下37,℃诱导4,h,重组蛋白产物经过Ni柱纯化、500,mmol/L咪唑洗脱,得到纯度较高的1.059,μg/μL的重组蛋白His-Nus A-insulin,重组蛋白His-Nus A-insulin经烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)酶切作用后,获得可溶的人胰岛素原.     

重组人瘦素蛋白的原核表达、纯化和生物学活性鉴定

为解决重组人瘦素蛋白(hLeptin)大规模生产过程中包涵体的形成以及体外重折叠过程中蛋白聚集导致的低产量,探究在大肠杆菌中hLeptin高水平可溶性的表达,并进行生物学活性检测.利用hLeptin成熟肽基因与pET-30a(+)-SUMO系统构建融合表达质粒pET-30a(+)-SUMO-Lep,转化至大肠杆菌BL21(DE3),加入异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)进行诱导表达,之后经Ni金属亲和层析纯化,并切去SUMO融合标签后获得成熟hLeptin.重组hLeptin表达量高,主要以可溶形式存在.通过KM小鼠减肥实验和CCK8实验证明重组hLeptin具有生物学活性.综上,使用SUMO融合标签,以增强hLeptin在大肠杆菌中的高效可溶性高纯度的表达,为大规模生产hLeptin提供了一种新方法,同时为表达可溶性重组蛋白研究提供了一定的基础.     

δ-氨基-γ-酮戊酸合成酶(ALAS)基因的克隆与原核表达

为获得ALAS的重组表达蛋白,以人肝脏组织cDNA为模板,通过PCR扩增得到ALAS全长片段并测序,成功构建了pET30a(+)-ALAS融合表达载体并转化大肠杆菌Rosetta(DE).IPTG诱导融合蛋白表达.SDS变性凝胶电泳结果显示,融合蛋白的分子量约70kDa,并且在上清液中有少量表达.经镍柱一步纯化得到His6-ALAS融合蛋白.     

人白细胞介素32的真核表达、纯化及生物学活性鉴定

摘要:目的：构建人白细胞介素32（IL-32）和IgG4基因Fc段的融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,建立稳定转染的中国仓鼠卵巢细胞（CHO/DG44）克隆,并检测重组蛋白的表达及相应的生物学功能.方法：采用聚合酶链反应(PCR)从LPS激活的人CD4+T细胞cDNA中扩增出IL-32基因,并克隆到构建IL-32融合基因的真核表达载体 IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC.经脂质体法转染CHO/DG44 细胞, 通过RT-PCR检测,筛选出实验组细胞,并对筛选的阳性克隆细胞再进行氨甲喋呤（MTX）加压筛选,利用ProteinG-Agarose亲和纯化培养上清中表达的融合蛋白,并通过SDS-PAGE、免疫印迹鉴定检测目的蛋白的表达,最后以 HeLa细胞为靶细胞测定重组蛋白的生物学活性.结果：构建了一个IL-32融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC;筛选出了能稳定表达IL-32-IgG4(Fc) 融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆; 亲和纯化后的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白在SDS-PAGE电泳后与预期分子质量大小相符,能够与羊抗人IgG-HRP 抗体特异结合,并能促进HeLa细胞的死亡.结论：成功构建了人IL-32融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,获得了能够表达具有生物学活性的IL-32-IgG4(Fc) 融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆.     

hIAPP与麦芽糖结合蛋白的融合表达、纯化和鉴定

基于人胰岛淀粉样多肽(h IAPP)的氨基酸序列,按照大肠杆菌(E.coli)密码子偏好性合成基因,并克隆到pMAL-c2x载体中,与MBP蛋白mal E基因融合表达,获得重组表达质粒pMAL-hIAPP.将质粒pMAL-hIAPP转化到表达宿主E. coli BL21(DE3)中,利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白MBP-hIAPP表达.SDS-PAGE电泳显示融合蛋白MBP-hIAPP的相对分子质量约为4.9×104.利用重组型烟草蚀纹病毒的半胱氨酸蛋白酶(rTEV)酶切MBP-hIAPP,并采用凝胶过滤层析的方法分离出高纯度的hIAPP,利用MALDI-TOF质谱进行了验证.     

重组VE-cad-Fc融合蛋白仿生构建细胞外基质

利用基因重组技术设计和构建了一种仿生的双功能仿生细胞外基质蛋白.其基本策略是将人血管内皮钙粘素胞外区(VE-cad)和免疫球蛋白(IgG1)Fc段进行基因融合构建真核表达载体,并利用FreeStyle293真核蛋白表达系统制备融合蛋白VE-cad-Fc,利用Western blot鉴定融合蛋白,并观察了该VE-cad-Fc融合蛋白基质对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)粘附和形态的影响.结果显示,成功克隆了VE-cad胞外段基因,并与Fc段重组形成VE-cad-Fc融合基因.在转染24h后,利用兔抗人VE钙粘素胞外区抗体验明该融合蛋白的免疫抗原性,其分子质量约为90.3KD,进一步的结果证明VE-cad-Fc融合蛋白是以二聚体的形式存在.优化该制备体系最佳表达时间为72h.细胞试验表明,VE-cad-Fc融合蛋白可显著促进HUVECs的粘附和生长.这种工程化的多功能融合蛋白基质在组织工程、再生医学和分子生物学领域有广阔的应用前景.     

BIG-3的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定

原核表达、纯化骨形态发生蛋白诱导基因（BIG-3,BMP-2-induced gene 3kb）所编码的融合蛋白并制备其多克隆抗体。将BIG-3基因插入原核表达载体PGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体,转化大肠杆菌BL21（DE3）菌株,诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达情况及Sepharose4B层析柱亲和层析法纯化的融合蛋白;用纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备其多克隆抗体,并以Western blot鉴定其特异性。结果在大肠杆菌中获得BIG-3-GST融合蛋白高水平的诱导表达,经Sepharose4B层析柱亲和层析,GST-BIG-3融合蛋白在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,所制备的多克隆抗体具有较高的特异性。说明在大肠杆菌中成功表达且以亲和层析法纯化得到了BIG-3-GST融合蛋白,并制备了特异性较高的多克隆抗体。     

重组Hepcidin融合蛋白的金属螯合亲和层析纯化

在大肠杆菌中表达的重组Hepcidin融合蛋白以包涵体形式存在,其N端带有6个组氨酸。以Ni²⁺-IDA-Sepharose Fast Flow为层析介质,在变性条件下以不同的咪唑和pH值洗脱方式对Hepcidin融合蛋白的纯化效果进行了比较,确定了该融合蛋白的金属螯合层析纯化条件。以60mmol/L咪唑洗脱杂蛋白,然后将pH值降至4.0洗脱融合蛋白,纯化后的融合蛋白纯度大于95%,而且不含咪唑,有利于下一步Hepcidin的制备。金属螯合层析中融合蛋白收率不低于90%。Ni²⁺-IDA-Sepharose Fast Flow对该融合蛋白的吸附量为30.4mg /mL。     

人表皮生长因子融合蛋白在大肠杆菌表达的研究

在大肠杆菌中高效表达人表皮生长因子(hEGF)。根据大肠杆菌对密码的偏爱性,构建高效表达EGF融合蛋白的菌株,经离子交换层析和凝胶过滤层析两个步骤使产物得到纯化。融合蛋白表达产量为27%,EGF融合蛋白纯化产物纯度为95%以上,促3T3细胞增殖的活性测定为ED50为4.2ng/mL。在pET 3c:BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中,以融合蛋白方式表达人表皮生长因子,表达效率高,纯化路线简单,产量较高,适合产业化生产。     

重组鲑鱼降钙素融合蛋白工程菌发酵工艺研究

为研究大肠杆菌表达重组鲑鱼降钙素融合蛋白(GST-sCT-Gly)工程菌的发酵工艺,采用瑞士比欧生物工程公司40 L发酵罐发酵,对影响工程菌生长和目的蛋白的表达条件进行优化;在优化条件下,以40 L发酵罐发酵工程菌,菌体收获量可达到57 g/L,目的蛋白表达量占总蛋白的23.5%;结果表明,研究确定的发酵工艺可以提高工程菌收获量及目的蛋白的表达量,且稳定可靠,可应用于生产。     

Expression ofChlamydomonas actin-gfp fusion gene in tobacco suspension cell and polymerization of the actin-gfp proteinin vitro

The fusion gene of actin (cDNA ofChlamydomonas reinhardtii) and green fluorescence protein (gfp) had been constructed into two expression vectors which could be expressed inE. coli and tobacco suspension cells BY2. The correct expression was observed inE. coli and BY2 with a fluorescence microscopy. The fusion protein, which took part in the membrane skeleton, was mainly located peripherally along the membrane, specially the fusion protein was distributed around nucleus and cell plate, while the fusion protein also forms F-actin in the cell. The fusion protein was purified from Bl21plus by ammonium sulfate fractionation, ion exchange chromatography and hydrophobic interaction chromatography. The purified production could polymerize into F-actin when the actin polymerizing buffer was added. It was demonstrated that the characteristics and function of actin inChlamydomonas was similar with those of animals and higher plants.     

PTD-Tat之C端融合在活体体内的跨膜递送作用

报道了Tat蛋白转导区域(PTD-Tat)的C端融合蛋白在线虫和小鼠体内的跨膜递送作用.将重组表达质粒pGEX-GFP-Tat在大肠杆菌中高效表达出的融合蛋白GST-GFP-Tat对小鼠腹腔注射(ip)17h后,荧光显微镜观察其心、肝和肾组织,均检测到强烈的绿色荧光,甚至该蛋白跨越了血脑屏障(BBB).此外用融合蛋白喂食线虫发现蛋白分布于线虫消化管道及其原体腔,且表现出的跨膜递送活性与喂食时间和蛋白浓度呈现正相关.该研究结果拓宽了PTD-Tat在蛋白药物递送方面的应用范围,为蛋白质疗法开辟了新的视野,并为其有效应用提供理论指导.     

人胰岛素样生长因子—Ⅰ的基因克隆,融合表达及产物纯化

利用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）方法,以ＩＧＦ－ＩｃＤＮＡ为模板,扩增ＩＧＦ－Ｉ的基因。在序列测定确证后,将其定向克隆到载体ｐＥｘＳｅｃＩ上,构建了ＩＧＦ－Ｉ融合表达载体ｐＥｘＩＧＦ,经ＩＰＴＧ诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明：含有重组表达质粒的菌株可表达出约３２．５８％的２６ＫＤ融合蛋白,且主要以可溶性形式存在。经ＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析一步纯化后,可获得纯度约９０％的融合蛋白,经Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ分析,免疫学活性呈阳性反应。     

AhAO2融合蛋白表达、纯化与抗体制备

构建AhAO2基因片段原核表达重组质粒pPROEX-Hta-AhAO2,表达质粒在E.coliBL21中诱导表达,获得His-AhAO2融合蛋白,采用亲和层析与电泳纯化His-AhAO2免疫,新西兰大白兔,获得抗His-AhAO2抗体,West-ern blot检测显示其只与His-AhAO2融合蛋白结合.实验成功制备了抗AhAO2特异抗体.     

花生AhAO2基因融合表达、纯化与抗体制备

研究构建AhAO2基因片段原核表达重组质粒pPROEX-Hta-AhAO2的实验结果显示,重组pPROEX-Hta-AhAO2表达质粒在E.coli BL21中高表达His-AhAO2融合蛋白,采用亲和层析与电泳纯化His-AhAO2免疫新西兰大白兔,获得抗His-AhAO2抗体,Western blot检测显示其只与His-AhAO2融合蛋白结合.实验成功制备了抗AhAO2特异抗体.     

高频等位基因HLA-A*1101重链胞外域-BSP融合蛋白原核表达载体的构建及表达鉴定

目的:构建HLA-A*1101重链胞外域羧基端融合生物素化酶B irA底物肽(BSP)的融合蛋白(HLA-A11-BSP)原核表达载体,并在大肠杆菌中表达该融合蛋白。方法:以RT-PCR法扩增并克隆HLA-A*1101重链基因的cDNA,以PCR方法构建HLA-A11-BSP的表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以免疫印迹法进行鉴定。结果:从HLA-A2阴性的供者外周血单个核细胞中克隆到HLA-A*1101重链基因的cDNA,以此cDNA为模板,将编码HLA-A*1101重链胞外域1~276序列与编码BSP的序列融合,构建HLA-A11-BSP融合蛋白表达载体,重组质粒经测序验证。融合蛋白在BL21(DE3)中诱导后获得高效表达,约占菌体总蛋白的20%;其相对分子质量约为35 000,与理论值一致。免疫印迹分析显示表达产物主要存在于包涵体中,上清液中几乎无任何产物存在。结论:成功构建表达HLA-A11-BSP融合蛋白的原核表达载体,该融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式获得高水平表达。