乙肝病毒核酸疫苗诱导小鼠细胞免疫应答的研究

研究利用核酸疫苗诱生乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原 (S)细胞免疫应答的作用 .免疫前于BALB/C小鼠股四头肌注射 75 %盐酸布比卡因 ,三天后同样部位注射包含HBsAg基因片段的重组质粒pcDNAHBs .采用3H -TdR掺入法测定免疫小鼠脾细胞增殖能力 ;XTT法测定其脾细胞分泌IL 2活性 .结果表明注射乙肝核酸疫苗可以使小鼠脾细胞增殖 ,小鼠脾细胞分泌上清中可检测到IL - 2活性     

恒河猴犬瘟热病毒基因疫苗制备单克隆抗体的研究

从感染犬瘟热病毒死亡的恒河猴肝脏组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增H全基因并克隆到真核表达质粒pVAX中,构建了基因疫苗pVAX-H。用制备的基因疫苗免疫BaLb/c小鼠,小鼠可以产生免疫应答,免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,经间接ELISA法筛选,获得5株稳定分泌抗CDV H蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。该5株单抗对应不同的病毒抗原表位,且均不与CPV和MV发生反应, McAb诱生的腹水可体外中和犬瘟热病毒,其中2株中和效价大于1:256。结果表明,CDV H基因疫苗可制备具有一定中和效价的抗CDV的单克隆抗体。     

恒河猴犬瘟热病毒基因疫苗单克隆抗体的制备

从感染犬瘟热病毒死亡的恒河猴肝脏组织中提取总RNA,经RT-PCR扩增H全基因并克隆到真核表达质粒pVAX中,构建了基因疫苗pVAX-H.用制备的基因疫苗免疫BaLb/c小鼠,小鼠可以产生免疫应答,免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后,经间接ELISA法筛选,获得5株稳定分泌抗CDV H蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株.该5株单抗对应不同的病毒抗原表位,且均不与CPV和MV发生反应,McAb诱生的腹水可体外中和犬瘟热病毒,其中2株中和效价大于1∶256.结果表明,CDV H基因疫苗可制备具有一定中和效价的抗CDV的单克隆抗体.     

甘油-3-磷酸对甲肝疫苗诱导的体液免疫影响*

目的 研究甘油-3-磷酸对甲肝疫苗诱导的小鼠体液免疫应答的影响。方法 选取49只雌性ICR小鼠,分7组,每组7只,这7组小鼠分别为阴性对照、单纯抗原组、铝佐剂组和4组甘油-3-磷酸组,分别在免疫之后的第4、8、12、16、20周用酶联免疫法(ELISA)测定小鼠血清中的特异性的anti-HAV IgG水平。结果 在小鼠免疫之后的第4、8、12、16、20周单纯抗原组、铝佐剂组和4组不同剂量甘油-3-磷酸组均能检测到特异性抗HAV抗体,并且趋势为先升高后降低,且在免疫后的第8周最高;第4周和第8周的甘油-3-磷酸实验组的结果均高于单纯抗原组,且差异均具有统计学意义(P<0.05),并且第4周甘油-3-磷酸组抗体水平均超过铝佐剂组,并具有统计学意义(P<0.05),其中甘油-3-磷酸2 mg为最佳剂量组,其抗体水平在免疫后的第4、8、12、16、20周均高于单纯抗原组,且在第8周抗体水平达到峰值,抗HAV IgG水平为lg(3.064±0.07851),铝佐剂的也是在第8周抗体水平达到峰值,抗HAV IgG水平为lg(3.150 ±0.1382)。结论 甘油-3-磷酸有免疫佐剂的作用,能够有效、迅速地增强HAV诱导的体液免疫应答,是一种潜在、安全有效的新型疫苗佐剂。     

肠毒素大肠杆菌LT—B基因转基因马铃薯口服免疫原性研究

探讨马铃薯表达的产肠毒素大肠杆菌热敏肠毒素B亚基口服免疫原性,选择4周龄的昆明白小鼠。转基因马铃薯块茎经冷冻干燥后,研磨成粉状,以灌胃给药的方式对小鼠进行免疫。分0.2 g、0.4 g和0.6 g三个剂量组,免疫三次,每周一次。对照组用5μg细菌中表达的抗原蛋白腹腔注射免疫小鼠,空白组小鼠饲喂普通鼠粮。利用ELISA方法对小鼠血清、粪便特异性抗体表达进行分析。结果有45%小鼠经转基因马铃薯口服免疫后可诱导特异性的免疫应答。与细菌表达的抗原免疫反应相比,血清IgG反应和黏膜sIgA反应略强或相当。说明产肠毒素大肠杆菌转基因植物疫苗免疫动物可诱导特异的系统免疫应答和黏膜免疫应答。为利用植物生产预防大肠杆菌性腹泻可食用的口服疫苗,保护儿童免受细菌性腹泻的侵染奠定了基础。     

肠毒素大肠杆菌LT-B基因转基因

目的 探讨马铃薯表达的产肠毒素大肠杆菌热敏肠毒素B亚基口服免疫原性。方法 选择4周龄的昆明白小鼠,转基因马铃薯块茎经冷冻干燥后,研磨成粉状,以灌胃给药的方式对小鼠进行免疫,分0.2g、0.4g和0.6g三个剂量组,免疫三次,每周一次,对照组用5μg细菌中表达的抗原蛋白腹腔注射免疫小鼠,空白组小鼠饲喂普通鼠粮,利用ELISA方法对小鼠血清、粪便特异性抗体表达进行分析。结果 有45%小鼠经转基因马铃薯口服免疫后可诱导特异性的免疫应答,与细菌表达的抗原免疫反应相比,血清IgG反应和黏膜sIgA反应略强或相当。结论 产肠毒素大肠杆菌转基因植物疫苗免疫动物可诱导特异的系统免疫应答和黏膜免疫应答,这一研究结果为利用植物生产预防大肠杆菌性腹泻可食用的口服疫苗,保护儿童免受细菌性腹泻的侵染奠定了基础。     

特定激活性吞噬受体的配体与广谱肿瘤抗原的化学生物学桥接

目前肿瘤疫苗制备方法尚无法做到将广谱肿瘤抗原通过特定激活性吞噬受体途径递送给抗原呈递细胞,这可能是现有肿瘤疫苗临床疗效不佳的原因之一.因此,本研究利用化学生物学方法,尝试将激活性吞噬受体的配体与广谱肿瘤抗原连接,为制备肿瘤疫苗提供新的方法.首先,通过非天然糖代谢掺入对培养的小鼠4T1乳腺癌细胞和CT26.WT结直肠癌细胞抗原进行标记,使糖基化肿瘤抗原携带叠氮化的唾液酸,利用流式细胞术和免疫荧光技术确定代谢掺入的最优条件参数.其次,利用生物正交反应使肿瘤抗原叠氮修饰位点再进一步共价缀合生物素,利用Western Blot检测蛋白的生物素化情况.最后,利用抗原-抗体结合原理,将小鼠抗生物素单抗(IgG1亚型,其Fc结构域是IgG1FcR的配体)与生物素化肿瘤抗原交联形成免疫复合物,通过Western Blot判断最优交联参数.实验结果表明,唾液酸前体物代谢掺入能高效地使肿瘤细胞发生叠氮化修饰,最佳浓度是2 mmol/L、最佳时间是24 h;通过生物正交反应能使叠氮化肿瘤抗原进一步生物素化;生物素化肿瘤抗原能高效地与抗生物素抗体形成复合物,二者交联的最佳比例(w/w)是20/1(4T1)或25/1(CT26.WT).结果证明,本研究通过化学生物学手段实现了广谱肿瘤抗原与特定吞噬受体的配体的交联,在方法学上为研制新型肿瘤疫苗奠定了基础.     

遵义医药高等专科学校学生乙型肝炎血清流行病学调查

分析遵义医药高等专科学校在校学生乙型肝炎病毒(HBV)感染状况,初步评价乙型肝炎(以下简称乙肝)疫苗免疫效果。以本校2009-2013级检验专业学生为检查的对象,对于被抽样检查的学生将其血清进行保存,应用ELISA法检测乙肝表面抗原(HBs Ag)、乙肝表面抗体(抗-HBs)和乙肝核心抗体(抗-HBc)等HBV感染指标,计算阳性率。2009-2013级检验专业学生HBs Ag阳性率在6.15%左右;抗-HBs的阳性率在19.40%;抗-HBc的阳性率14.17%。男生HBs Ag的阳性率高于女生(P0.05)。学生仍然是乙型肝炎病毒感染的对象,加强学生乙肝疫苗接种是预防和控制乙型肝炎的重要措施。     

用于乙肝疫苗效力检定的小鼠种群的建立

目的在进行乙肝疫苗效力检测时应用统一的动物种群。方法目前评价乙肝疫苗免疫效力的主要方法是用小鼠测定乙肝疫苗的ED50值(接种疫苗后使50%的动物抗体阳转的疫苗稀释度的倒数),而小鼠对HBsAg免疫应答的水平与H-2单倍型密切相关。因此我们通过微量细胞毒法和PCR方法检测小鼠的H-2单倍型的特点,得出乙肝疫苗与不同动物种群的相关性,解决实际工作中的问题。结果通过多方面的实验验证,NIH鼠可以对乙肝疫苗产生高应答效应。结论NIH鼠的H-2单倍型中有q型基因,同时NIH鼠保持了原封闭群动物繁殖力强生长速度快等优点,所以便于进行乙肝疫苗效力检测时应用。     

抗基因工程人rIFN-γ杂交瘤细胞株的建立

用杂交瘤技术将基因工程人γ－干扰素（ｒＩＦＮ－γ）免疫的Ｂ淋巴细胞与ｓｐ２／０鼠骨髓瘤细胞融合，建立了 ３株抗 ｒＩＦＮ－γ杂交瘤细胞株。这些细胞株经两年多的传代培养仍保持稳定分泌抗体的能力，并与ｒＩＦＮ－γ及新型γ－干扰素呈特异性反应，可用于亲和层析纯化γ－干扰素．     

以抗的表位为基础的基因免疫

基因免疫（ｇｅｎｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）是指通过将目的基因克隆于真核表达载体后直接注入机体,表达相应抗原,诱生免疫应答。１９９０年,Ｗｏｌｆｆ等在研究ＤＮＡ的化学损伤及修复时偶然发现：肌肉注射含有编码虫荧光素酶（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）报告基因的裸露质粒ＤＮＡ时,在注射局部有该报告基因的表达及酶活性表现。此后的研究发现表达的蛋白可在机体内诱生特异性的体液免疫应答。１９９３年,Ｕｌｍｅｒ等半流感病毒ＮＰ表达质粒注射入小鼠骨骼肌,不仅检测到特异性ＩｇＧ抗体,而且免疫小鼠的脾细胞在体外可特异杀伤Ｎ…     

重组人源性抗HBsAg Fab抗体的特性分析

通过噬菌体展示技术从含高滴度抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗体的人外周血淋巴细胞获得抗HBsAg Fab抗体的轻、重链基因．将Fab的轻、重链基因分别整合到巴斯德毕赤酵母(Pichua pastons)GS115菌株的染色体上，成功构建了高效分泌表达抗HBsAg Fab抗体的酵母工程菌．对酵母表达的重组Fab抗体进行了纯化，并对其相对分子质量、糖基化以及抗原结合能力等特性进行了分析，结果显示重组酵母分泌表达的重组人源性抗HBsAg Fab是一个相对分子质量为50000左右的低糖基化糖蛋白，1mg重组Fab抗体相当于40u的抗乙肝表面抗原抗体(20U／mg)．表明重组Fab抗体具有较强的结合HBsAg的能力．     

0-65岁住院患者乙型肝炎病毒感染率的调查分析

为了降低住院患者HBV的感染率及预防乙肝引起的医院性感染,有必要探讨HBV在住院患者中的感染状况。对2009~2011年收治的2270名住院患者用ELISA法检测乙肝表面抗原(HBs Ag)、乙肝表面抗体(抗-HBs)、乙肝e抗原(HBe Ag)、乙肝e抗体(抗-HBe)、乙肝核心抗体(抗-HBc)五项血清标志物。住院患者HBV感染率62.47%,其中HBs Ag阳性率12.73%。正常对照组HBV、HBs Ag阳性率为50.10%、3.87%。对289例乙型肝炎病毒表面抗原﹙HBs Ag﹚阳性住院患者进行分型,e抗原阳性率35.99﹪,E抗原阴性率64.01﹪。正常对照组E抗原阳性率10.13﹪,e抗原阴性率89.87﹪。对各感染率进行标化后与正常对照组比较有统计学意义。标化后住院患者HBs Ag感染率为健康体检组的3.50倍(P0.01),e抗原阳性率为健康体检组的3.55倍(P0.01),HBV为健康体检组的1.23倍。住院患者既是HBV高危易感人群又是乙肝传染源。     

一株乙型肝炎病毒鼠单抗的人源化及生物学活性鉴定

乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球最为重要的公共卫生问题之一,目前临床上治疗HBV的药物在彻底清除病毒方面并没有取得满意的结果,因此迫切需要发展能有效清除病毒,尤其是能有效清除乙肝表面抗原(HBsAg)或大幅度降低HBsAg血清学水平的创新性治疗药物.筛选到一株针对HBV和HBsAg上一个特定表位的鼠单抗129G1,它能持续有效地清除转基因小鼠体内的HBV及HBsAg,有发展为治疗性抗体药物的潜力.为了降低129G1的免疫原性,采用互补决定区(CDR)移植的方式,利用噬菌体抗体库技术对这个鼠单抗进行了人源化,最终得到人源化抗体.人源化抗体与HBsAg的结合活性与嵌合抗体相当,抗体质量浓度为1.45μg/mL时介导THP-1细胞吞噬率达到50%.在HBV转基因小鼠的实验中,获得的129G1人源化抗体能持续有效地抑制血清中HBV DNA及清除HBsAg.     

淋巴囊肿病病毒主要衣壳蛋白1.3kb基因真核载体的构建及初步免疫

从LCDV1．3kb／pGEX-4T1质粒酶切获得LCDV1．3kb基因片段,构建重组真核表达质粒LCDV1．3kb/pcDNA3．1（＋）;并将其免疫BALB／c小鼠,用ELISA法检测免疫小鼠血清中抗LCDV抗体和IFN-γ。结果发现免疫小鼠可产生特异性抗LCDV抗体,平均效价为1：40,最高效价达1：320,但小鼠血清IFN-γ平均含量在30pg／mL左右,与阴性对照组无明显差异。结果表明,所构建的重组表达质粒LCDV1．3kb/pcDNA3．1（＋）免疫小鼠后可成功诱导其特异性体液免疫应答,但细胞免疫应答不明显,可能与所选载体、免疫动物种类及免疫方法有关,其具体原因有待于进一步探索。此研究为LCDV基因工程疫苗的研制提供了实验资料。     

抗促黄体激素单克隆抗体的研制 Ⅰ杂交瘤细胞株的建立

用促黄体激素(LH)为抗原免疫BALB/C小鼠,通过免疫小鼠脾细胞和SP_2/0小鼠骨髓瘤细胞的融合,产生分泌抗LH单克隆抗体(McAbs)的杂交瘤细胞。用ELISA法检测融合细胞培养上清,从195份检样中测出两份能与LH抗原起反应。对该2孔杂交瘤细胞进行亚克隆和扩大培养。经体外四个月传代培养及液氮冻存后复苏培养。仍保持分泌抗LH的McAbs的能力,所建立的二株杂交瘤细胞命名为AL—01和AL—02。给予注液体石蜡的BALB/C小鼠注入该二种细胞,均能诱生腹水。用ELISA法测腹水抗体,效价分别为10~(-6)以上和10~(-5)以上。通过染色体组型分析,确认AL—01和AL—02皆为杂交瘤细胞。     

结核分枝杆菌膜蛋白Rv0849免疫学特性的初步检测

探讨了结核分枝杆菌膜蛋白Rv0849作为药泵蛋白的转运功能及其作为外源蛋白免疫诱导C57BL/6小鼠产生免疫应答的能力.从H37Rv基因组中扩增获得Rv0849基因,酶切后连接到分枝杆菌穿梭质粒pMV261上构建重组质粒pMV0849,并以耻垢分枝杆菌为载体构建获得重组菌株SM(0849).检测药物对重组菌株SM(0849)的最小抑菌浓度(MIC)变化,用重组菌株免疫C57BL/6小鼠检测其作为外源蛋白免疫诱导小鼠产生的免疫应答反应.结果表明,重组菌株SM(0849)对药物的耐受性没有明显提高,但能够较早、较好地诱导小鼠体液免疫应答水平,并能通过刺激小鼠脾脏淋巴细胞促使其分泌高水平的肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ.Rv0849所编码的蛋白具有较弱的药泵功能,但有潜力成为一种新的免疫抗原.     

免疫接种乙肝疫苗防治效果探讨

目的：了解免疫接种乙肝疫苗后产生乙肝病毒表面抗体（抗-HBs）的阳性率和人群乙肝病毒（HBV）的感染率,来评价1992年我国乙肝疫苗纳入儿童计划免疫管理和2002年乙肝疫苗纳入儿童计划免疫以及卫生部/全球疫苗免疫联盟乙肝疫苗合作项目实施的效果。方法：对所有调查对象均采集静脉血4ml,由中国疾病预防控制中心病毒病所统一使用酶联免疫吸附试验（ELISA）方法对标本进行检测,统一检测表面抗原（HBsAg）,抗-HBs,核心抗体（抗-HBc）,对HBsAg阳性者再做e抗原（HBeAg）和e抗体（抗-HBe）检测。根据乙肝疫苗推广的时间分为1～4岁组69人,5～14岁组89人,15～59岁157人,对检测结果进行相关分析。结论：乙肝疫苗的推广和乙肝疫苗纳入儿童计划免疫对全人群的免疫水平都有很大的提高,尤其对婴儿预防乙肝病毒感染有显著的效果。     

弓形虫SAG1,ROP1基因及其复合抗原基因的核酸免疫研究

目的 检测混合SAG1和ROP1编码基因真核表达质粒疫苗诱导小鼠的免疫应答,评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果.方法 将SAG1和编码基因片段克隆入pEGFP-N3表达载体,构建重组质粒;RT-PCR体外验证重组质粒在NH3T3细胞中的表达;通过检测抗体、抗体分型及细胞因子来评价体液免疫和细胞免疫;腹腔内注射毒性株弓形虫速殖子攻击免疫小鼠.结果 RT-PCR结果显示重组质粒能在哺乳动物细胞内表达;SAG1和ROP1混合重组质粒疫苗诱导小鼠产生很强的体液免疫和细胞免疫,对于毒性株弓形虫感染攻击具有保护作用.结论 不同候选抗原编码基因重组质粒能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫,提示含有多种成分的混合DNA疫苗的研制可作为核酸免疫研究的策略之一.     

汉滩病毒G1重组腺病毒的表达及其免疫学特性研究

将汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G1重组腺病毒(Adeno-G1)感染VeroE6细胞,用IFA法检测其表达产物;并进一步将其免疫Balb/c小鼠。结果可检测到HTNV糖蛋白G1在VeroE6细胞中表达;用该重组腺病毒免疫小鼠,结果表明免疫小鼠体内可诱导产生抗汉滩病毒G1特异性抗体,同时微量细胞培养中和实验结果表明重组腺病毒还可刺激机体产生低水平的中和抗体,但淋巴细胞增殖反应不明显。说明Adeno-G1免疫小鼠后,主要刺激机体产生特异性的抗HTNV体液免疫应答,但刺激机体产生特异性的细胞免疫应答不明显,为HTNV基因工程疫苗的研究提供了实验基础。