不同破壁方法对海洋毕赤酵母提取物的提取及应用

摘要：海洋酵母作为重要的微生物资源越来越受到重视. 本实验以从红树林沉积物中分离的海洋酵母?Pichia guilliermondii SY-19菌株作实验材料,制成质量浓度分别为5%、7.5%及10%的细胞悬液,用蜗牛酶法、双酶法（甘露聚糖酶和-葡聚糖酶）及热碱法等3种方法分组进行破壁处理12 h,每3 h检测1次酵母细胞数量及多糖、蛋白质、氨基氮和核酸等营养物质的含量,计算得率,确定合适的方法制备酵母提取物;对经有害无机氮胁迫处理2周的凡纳滨对虾,分别以配合饲料、菌液拌料和酵母提取物拌料投喂3周,比较对虾的存活率及生长状况. 结果表明,热碱法处理的破壁率和核酸提取量最高,但其他营养物含量稳定性差;而双酶法处理的蛋白质、氨基氮和多糖的得率最高且营养保留效果较好,以该法最佳条件即5% 酵母悬液处理12 h制备酵母提取物作为饲料添加剂。胁迫过的对虾经3周的饲养恢复,其增重和存活率表现为酵母提取物拌料饲喂的对虾最高（77.674.62%, 2.790.11g）,菌液拌料饲喂的次之（62.009.90%, 2.440.16 g）,未拌料的最低（53.6712.91%, 2.190.02 g）,对虾存活率上三组有显著差异（p0.05）,添加酵母提取物的与未拌料对照组的终体重存在显著差异（p0.05）。本文的研究结果表明该菌株在对虾健康养殖中具有较好的潜在价值.     

巴斯德毕赤酵母表达系统及其在医学领域的应用

毕赤酵母表达系统是近几年在外源蛋白表达方面应用比较广泛的一套工具,到目前为止,已用这个系统成功表达了200多种来自病毒、细菌、真菌、动植物和人的蛋白,如人白介素、人血清白蛋白、乙肝表面抗原、水蛭素等。本文就巴斯德酵母细胞的基本特性、宿主菌及其质粒、影响外源蛋白表达的因素和在医学上的应用作一综述。     

毕赤酵母表达系统的实际应用研究

在DNA体外重组和异源表达技术中,酵母表达系统是重要的一个组成部分。对于它的优势,大量中外文献用实例证明,用综述总结。酵母菌是最简单的真核模式生物,兼有原核、真核两种表达系     

不同湿重诱导对毕赤酵母发酵生产植酸酶的影响

为了提高毕赤酵母工程菌（Mut+）植酸酶的表达量,对毕赤酵母工程菌50 L发酵生产植酸酶的工艺条件进行了研究。结果表明,通过流加葡萄糖提高菌体湿重到300 g/L,随后停止流加,溶氧回升后流加甲醇开始诱导,最终发酵结束时,植酸酶酶活达到21 666 U/mL,比对照提高12.9%,该诱导湿重有利于发酵生产植酸酶。     

银杏花粉不同破壁方法的比较分析

试验比较了匀浆机破壁、高压细胞破碎仪破壁、温差破壁、酶法破壁等4种破壁方法对银杏花粉的破壁效果。结果表明：匀浆机破壁法优于其他破壁方法,且操作简单,能达到破壁要求。匀浆机破壁的最佳工艺参数为：转速15 000 r/min、花粉(g)与水(mL)的配比即料液比1∶50、时间10 min,破壁率达99.6%。     

毕赤酵母表达不同拷贝数风味肽的呈味性比较

应用毕赤酵母发酵表达不同串联拷贝牛肉风味肽(4BMP、8BMP、12BMP、16BMP).分别以不含风味肽的发酵液和牛肉汤作对照,经过美拉德反应制备牛肉香精.对不同串联拷贝数的BMP制备的牛肉香精风味特性进行感官评价.结果显示:由不含BMP的发酵液制备的牛肉香精特征味不明显,总体肉香味弱;由牛肉汤制备的牛肉香精特征味明显,但强度弱;以含多拷贝BMP发酵液制备的牛肉香精肉香味和特征味明显.其中4BMP总体香味不和谐;8BMP、12BMP、16BMP牛肉特征突出,肉香味明显,且权重评分方差分析显示3种多肽制备的牛肉香精总体风味无显著性差异.所以,BMP作为基料进行美拉德反应可以提升产物的牛肉特征味和总体肉香味,而拷贝数的增加对风味的影响并不显著.     

蛇神经毒素在毕赤酵母中的分泌表达及其分离纯化

文中主要研究了毕赤酵母基因工程菌的构建及其发酵表达产物蛇神经毒素的分离纯化条件。蛇神经毒素编码基因由本实验室设计、合成，并重组构建成表达质粒pPIC9k-hPK。经电穿孔将该质粒转化毕赤酵母GS115 (His-Mut+)，筛选His+Muts型菌株，经诱导表达，产物进行SDS- PAGE电泳鉴定，相对分子质量与理论值一致，目标蛋白经小试发酵产量可达350mg/L。利用超滤、离子交换树脂及分子筛分离纯化，产物经高效液相色谱(HPLC)分析纯度达92%。     

黑鲷抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

鱼类抗菌肽hepcidin具有广谱抗菌活性.利用PCR技术扩增获得了黑鲷抗菌肽hepcidin (AS-hepc2)的前体肽和成熟肽 cDNA 序列,片段大小约250 bp.将其与毕赤酵母(Pichia pastoris) pPIC9K 质粒连接,构建了分泌表达载体pPIC9K/AS-hepc2 .电击法转化重组表达载体,经过G418筛选和选择性培养基以及PCR鉴定,得到的克隆子都为Mut+.以甲醇诱导pPIC9K/AS-hepc2,分泌表达上清中获得10 ku左右的表达产物,与预期的目的蛋白黑鲷hepcidin的前体肽和成熟肽的大小相符.表达试验证明,随时间的延长,表达产物量增多,至120 h 达到高峰.表达产物具有很强的热稳定性.用抑菌圈法测定重组蛋白Pro-AS-hepc2 的抗菌活性,发现能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长.     

灵芝孢子的破壁方法及其药理作用研究进展

灵芝,其子实体、孢子粉均可食用或入药,其中灵芝孢子具有灵芝的全部遗传活性物质,其药用价值日益受到重视.研究发现,灵芝孢子具有抗癌、免疫调节、抗氧化、神经保护、保肝和抗糖尿病等药理作用,但由于灵芝孢子壁具有一层坚硬的几丁质外壳,不易破碎,影响其功效的发挥.为了灵芝孢子的合理开发和应用,综述了近年来灵芝孢子的破壁方法及其药理作用,以期为灵芝孢子产品的研究与开发提供一定的参考价值.     

兔IL-15蛋白在毕赤酵母中的表达及其免疫学活性

用特异性引物扩增出兔IL-15基因片段,用KpnI和NotI双酶切后将其定向克隆到pPICZαA中,构建出重组质粒pPICZαAIL-15。将pPICZαAIL-15用SacI内切酶线性化后,电转化感受态GS115酵母细胞,用PCR法筛选阳性重组子。用1.5%的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测。结果SDS-PAGE电泳可在重组酵母菌培养物上清中检测到分子量为18.6kDa大小的重组蛋白。凝胶薄层扫描分析表明,3株重组酵母菌在1.5%甲醇诱导144h后,重组IL-15表达量约占培养物上清总蛋白量的6.1%~8.6%。将重组IL-15用Ni离子亲和层析纯化后,在MTT试验中表现出明显的促进淋巴细胞的增殖反应,证实表达的重组IL-15具有天然蛋白的免疫学活性。     

人胰岛素原密码子的优化及其在毕赤酵母中的表达

依据毕赤酵母偏好密码子,设计合成长效人胰岛素原( human proinsulin,HPI)基因序列,所合成的HPI基因全长为200 bp,并在其N端添加信号肽(EEAEAEAEPK)以提高目的蛋白表达.将改造后基因克隆到pPIC9K载体中,构建分泌表达型载体pPIC9K-HPI,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中.用遗传霉素G418梯度筛选获得高拷贝菌株,在甲醇诱导下表达分子质量为7.87 ku的HPI,利用金属螯合层析纯化蛋白质,胰蛋白酶酶切后利用人胰岛素试剂盒测得生物活性,HPI摇瓶最高产量可达35.4mg/L.该研究为获得大量长效胰岛素基因工程产品奠定研究基础.     

重组海葵毒素AP-b毕赤酵母表达体系的建立及其鉴定

按照毕氏酵母的偏爱密码子,设计并合成了海葵毒素AP-b的基因序列,将合成基因序列通过一系列操作导入毕氏酵母表达载体pPICZa中,以电穿孔方法转化毕氏酵母菌株X33,通过PCR法鉴定,筛选出能够表达重组海葵毒素的酵母菌株.结果表明,构建出海葵毒素AP-B毕赤酵母真核表达体系,并鉴定出4株含有海葵毒素基因的毕赤酵母工程菌.     

曲霉属糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

从黑曲霉、无花果曲霉、米曲霉中提取总RNA,RT-PCR分别获得其糖化酶基因,所得序列在Gen-Bank数据库中注册,注册号分别为AY652617、AY642120和DQ211971.BLAST分析显示,克隆的曲霉属糖化酶基因与GenBank数据库相应序列同源性很高.将这些糖化酶基因与表达载体pPIC9重组后,电转化进毕赤酵母株GS115,均获得了分泌表达糖化酶的酵母工程菌株.甲醇诱导72 h后,糖化酶的分泌量达到最高,分别为(11.6±0.2)、(12.4±0.2)和(10.0±0.2)U/mL.SDS-PAGE显示,分泌表达的糖化酶分子量均约为80 kDa.     

喷水推进器进流面获取方法及其应用

针对国际拖曳水池会议(ITTC)推荐的动量流量法需要确定喷水推进器流道进流面的问题,提出了简单实用的基于流线法的进流面获取方法,并采用MATLAB语言开发成程序,使这一过程大大简化,提高了效率.在此基础上,采用稳态多重参考系(MRF)模型,通过求解RANS方程对不同转数下喷水推进器的性能进行了数值计算与分析.研究结果表明:该方法可以准确获得进流面形状,并可给出进流面形状的参数化表达;进流面形状、泵前进口面速度分布以及唇部流动分离点位置都随转速变化而变化.所提出方法具有一定的实用性,可用于喷水推进器性能的预报.     

不同拷贝数及间隔肽序列对毕赤酵母分泌表达EXA的影响

通过多拷贝串联表达,以及在分泌信号序列和目的蛋白N端之间插入几个氨基酸的间隔短肽,以提高exendin-4类似物串联体EXA在重组毕赤酵母中的分泌表达水平.实验结果表明:2～5个EXA串联插入均比单个EXA插入有利于提高表达水平,而4拷贝EXA串联体的表达产物较多滞留在胞内.在EXA的N端增加间隔肽可促进蛋白分泌,与不含间隔肽序列的4拷贝EXA串联表达载体相比,含有糖基化位点(NTTEEGEPK)和肠激酶识别位点(DDDDK)间隔肽的插入,使蛋白表达水平分别提高了4倍和9倍.     

浸泡预处理提取伊朗蒿精油及其对毕赤酵母的抑制作用研究

目的:研究浸泡预处理提取伊朗蒿精油的最佳条件及精油的抑菌效果.方法:采用浸泡预处理,并试用不同的条件对精油进行提取,同时采用滤纸片扩散法来检测精油对于毕赤酵母生长的抑制作用.结果:浸泡预处理提取伊朗蒿精油的最佳工艺是料液比为1∶15;浸泡预处理24h后回流5h,得到的精油量为12.0ml/kg.结论:伊朗蒿精油对于毕赤酵母的生长具有明显的抑制作用.     

猪胃蛋白酶原A在毕赤酵母中的高效表达及其分离纯化

尝试利用毕赤酵母(pichia pastoris)表达体系大量生产制备猪胃蛋白酶,用化学的方法合成猪胃蛋白酶原A基因,并构建表达载体pGAPZα-pepsinogen;利用化学转化技术,将该基因整合到巴斯德毕赤酵母x-33菌株的染色体上.经过发酵,三角摇瓶培养条件下获得的猪胃蛋白酶原A总酶活达5 250U/L.发酵液上清经过DEAE离子交换色谱和Sephacryl S-200分子筛色谱分离,活化酶原后测定其比活达到52 800 U/g.     

一种获取Web结构切片的方法及其应用

程序切片是一种程序分析方法,在软件的理解、调试、维护、测试以及逆向工程中发挥中着重要的作用.Web应用程序的编码特性与传统程序有着较大的区别,因此,传统的切片方法难以适用.在分析Web应用程序语句特征的基础上,定义了由页面引起的Web页面间的各种依赖关联,并构建了Web应用结构依赖图WAStrDG.基于WAStrDG所实现的Web结构切片算法有助于获取Web结构层次的信息,可以有效提高Web的测试和维护效率.     

不同破壁方法对活性污泥总DNA提取效果的影响

分别采用酶法、化学法、珠磨匀浆法和反复冻融法对活性污泥样品进行破壁，提取总DNA，并通过提取的核酸总量、纯度、片段分布情况、是否含有聚合酶链反应抑制剂以及基因间隔序列(ITS)扩增产物多态性等5个指标来评价不同的细胞破壁方法对活性污泥总DNA提取效果的影响。结果表明，化学法的优势最明显，提取的总量最多，大片段提取效果好，虽然杂质较多，但不影响聚合酶链反应，方法的偏倚性最小。