Pericardin蛋白的表达纯化以及多克隆抗体的制备

Pericardin 基因是果蝇心脏发育的标记基因,在果蝇心脏发育过程中起着重要的作用.从果蝇体内提取出总RNA,反转录得到果蝇的cDNA,将其作为模板.通过生物信息学分析,选择Pericardin 基因抗原亲水区,选取特异性高的片段.将PCR片段克隆到原核表达pET28a(+)载体上,转入E.coli后通过IPTG(Isopropyl β-D-thiogal actoside)诱导表达His融合蛋白,蛋白经分离纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.经Western Blot 检测抗体的效价和特异性.结果显示,获得了Pericardin原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Pericardin 多克隆抗体,为Pericardin 功能的进一步研究奠定了基础.     

斑马鱼心脏标记基因pitx2的多克隆抗体的制备

pitx2基因是一类bieoid相关的同源异型框因子成员,介导心脏左右不对称发育和内脏器官的偏侧化.pitx2基因位于Nodal信号途径的下游,直接由Nodal信号分子控制.用PCR技术扩增斑马鱼pitx2基因的部分编码区,并将其插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,经过酶切和测序鉴定后,将重组质粒(pGEX-4T-1-pitx2)转入B121感受态细胞,通过IPTG诱导表达融合蛋白.用GST珠亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体.获得了pitx2原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗pitx2多克隆抗体.提取斑马鱼不同器官和组织蛋白,用自制的多克隆抗体检测pitx2基因在斑马鱼中的表达情况,发现pitx2基因特异性地在心脏、脑、肌肉、小肠和肝脏表达,尤其在心脏中有很高的表达,表明制备的抗体特异性非常好.     

莱茵衣藻IFT144蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为后续研究纤毛相关蛋白IFT144的功能,通过构建重组表达载体获取IFT144抗原蛋白,利用纯化过后带有His标签的IFT144抗原蛋白免疫新西兰白兔,收集4次免疫后的血清,间接ELISA法测定抗血清效价为1∶521 000。经Western blot及免疫荧光技术检测表明,纯化后的抗血清能够与Chlamydomonas reinhardtii 21gr(CC1690)鞭毛IFT144蛋白特异性结合,说明anti-IFT144特异性良好。该抗体效价高,特异性良好,为IFT144蛋白的功能及其相关机制的研究提供了实验材料。     

果蝇血液发育标记基因mrj的多克隆抗体制备及检测

mrj是黑腹果蝇中一个蛋白编码基因.根据已报道的mrj基因序列,利用生物信息学分析选取果蝇mrj基因抗原亲水区,通过PCR扩增出其部分编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上.经酶切及测序鉴定质粒构建成功后,将重组质粒(pET-28a-mrj)转入Rosetta菌后通过IPTG(Isopropy1β-D-thiogalactoside)诱导表达出带His标签的重组融合蛋白后用镍柱纯化.将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体的效价和特异性.     

EPS8蛋白的表达、多克隆抗体制备及其亚细胞定位

EPS8 (EGFR pathway substrate 8)是epidermal growth factor receptor (EGFR)重要的激酶活性底物之一,近年有研究表明其与神经胶质瘤密切相关.为了对该基因进行深入的功能研究,成功地将EPS8基因构建于原核表达载体pGEX-4T-2,转化BL21(DE3)获得融合表达产物,用GST-EPS8(-10-230aa)免疫新西兰大白兔获得兔抗EPS8多克隆抗体.采用Western Blot,用该抗体检测EPS8基因的真核表达产物,证明该抗体有较好的针对EPS8蛋白的专一性,可用于对EPS8的结构和功能研究.同时,用该抗体通过荧光免疫细胞对4种神经胶质瘤细胞系进行定位分析发现,EPS8蛋白主要分布于胶质瘤细胞的细胞质中.     

人巨细胞病毒包膜糖蛋白B的B细胞抗原表位预测

目的:通过生物信息学方法分析人巨细胞病毒包膜糖蛋白B(gB)的三级结构并预测其线性B细胞抗原表位.方法:根据人巨细胞病毒gB蛋白的胞外域序列,利用DNAStar软件分析其二级结构和表面特性,联合在线B细胞表位预测程序BcePred,通过其理化特性来综合预测该蛋白可能的线性B细胞抗原表位;利用SWISSMODEL服务器的同源建模方法构建gB蛋白的三级结构模型,对在生理三聚体条件下该蛋白各预测表位进行验证.结果:成功预测出人巨细胞病毒gB蛋白的多个线性B细胞抗原表位区段,其中预测出的5个表位区段不属于任何已发现的抗原区域,为后续验证其优势中和表位,研制安全、高效的表位疫苗奠定了理论基础.     

鳜鱼肌球蛋白重链基因的原核表达及多克隆抗体的制备

肌球蛋白重链(MyHC)是肌肉中的主要结构和功能蛋白,在肌肉收缩过程中起关键作用.根据鳜鱼肌球蛋白重链基因中高亲水性区域DNA设计一对特异性引物,将该基因片段亚克隆到pET-32a质粒,构建重组表达载体并转化入大肠杆菌BL21中.诱导条件优化实验结果显示,该菌株经0.8 mmol/L IPTG诱导3 h可大量表达融合蛋白.将经亲和层析纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.ELISA和免疫组化测试结果表明:此抗体有较好的特异性和抗原性.鳜鱼MyHC基因表达的研究为深入研究肌球蛋白重链的功能特性及其对肉质性状的影响奠定基础,为提高鱼类肉质提供理论基础和技术支持.     

果蝇Mef2基因多克隆抗体的制备及检测

为了在果蝇模型中进一步研究Mef2基因的功能,制备了Mef2多克隆抗体.以果蝇cDNA文库为模板,PCR扩增出亲水性和特异性均好的果蝇Mef2基因片段,将其克隆入pET-28a原核表达载体,然后将重组质粒转化入大肠杆菌菌株Rossetea,用IPTG诱导表达融合蛋白.融合蛋白先经Ni-IDA凝胶柱纯化,再免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,然后用不同浓度的抗体分别进行Western-blot实验检测抗体效价.所得结果显示获得了较高效价的果蝇Mef2多克隆抗体.     

斑马鱼HAS2基因的克隆、抗体制备及分析

HAS2是斑马鱼心脏发育的一个标志基因,为了利用斑马鱼动物模型进一步研究HAS2基因在心脏发育中的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了斑马鱼HAS2基因的片段.将所得的片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并将重组质粒(pGEX-4T-1-HAS2)转化大肠杆菌(E.coli)BL21,IPTG诱导表达GST-HAS2融合蛋白;通过尿素洗涤沉淀蛋白并切胶回收纯化融合蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体活性.生物信息学分析结果表明:斑马鱼HAS2基因的开放阅读框含有1658 bp,编码552个氨基酸;SDS-PAGE电泳分析显示,IPTG诱导表达的融合蛋白相对分子质量约为4.5×104;Western blotting分析表明,制备的抗体具有良好的特异性.     

斑马鱼hand2基因的克隆、抗体制备及分析

为利用斑马鱼动物模型进一步研究bHLH转录因子家庭重要成员hand2基因在心脏发育中的功能,采用生物信息学结合RT-PCR的方法获得了斑马鱼hand2基因.将所得片段插入原核表达载体pGEX-4T-1中,并通过IPTG诱导表达出GST-Hand2融合蛋白,经GST亲和层析法纯化后,免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体,利用western blotting和免疫组化的方法对抗体进行分析.分析表明:斑马鱼hand2基因成熟肽编码区含有627 bp,编码208个氨基酸,与人Hand2蛋白的同源性达到83%;IPTG诱导表达后,表达的融合蛋白占菌体总蛋白的71%,经GST纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带.融合蛋白相对分子质量约为49 000.分析表明,制备的抗体具有很好的特异性.     

果蝇nulp1特异性多克隆抗体制备及检测

为了利用果蝇模型研究nulp1蛋白在早期心脏发育中的功能,采用PCR技术扩增出果蝇nulp1基因的部分编码区并插入到pET28a表达载体中.之后将重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)Rosetta( DE3);通过IPTG诱导表达His-nulpl融合蛋白,该融合蛋白采用Ni2+金属螯合层析纯化后,免疫新西兰兔制备了多...     

DNAStar软件在动物病毒研究中的应用实例

利用DNAStar软件包中的Editseq软件将TGEV TH98株spike基因核苷酸序列翻译成氨基酸序列,然后利用Protean软件进行氨基酸序列分析,预测二级结构及B细胞抗原表位.结果表明,TGEV spike蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,含有较多潜在的B细胞抗原表位,包括43～56,97～104,117～128,132～173,238～257,391～398,535～706,779～799,918～987,1165～1200,1257～1266和1430～1446aa区段.     

抗氟甲砜霉素多克隆抗体的制备与鉴定

为建立氟甲砜霉素的免疫分析方法,采用混合酸酐法合成氟甲砜霉素人工抗原(FF-HS-BSA)和包被抗原(FF-HS-OVA),并利用紫外吸收光谱及红外光谱扫描方法检测到人工合成抗原偶联成功。利用合成的人工抗原免疫5只6～8周龄BALB/c小鼠,免疫8次后得到氟甲砜霉素抗血清。利用间接非竞争酶联免疫吸附测定法检测抗体效价为1∶6400,可用于进一步实验研究。     

基于免疫信息学的表位疫苗设计研究进展

表位疫苗设计的一般流程是基于已知核苷酸或氨基酸序列,利用计算机辅助的免疫信息学分析等技术确定和筛选可能的优势表位,然后人工合成或借助基因工程技术制备含有优势表位的多肽疫苗.表位疫苗的合理设计是成功制备表位疫苗的关键,近年来的一系列研究使表位疫苗的设计思路和使用工具有了新的进展和突破.从抗原的选择和优化、B细胞抗原表位预测、T细胞抗原表位预测、多肽接头的选择和表位疫苗设计的评估等方面综述了基于免疫信息学的表位疫苗设计的最新研究进展,重点介绍了设计开发过程中所使用的常用计算机软件和工具.基于计算机辅助的免疫信息学分析可以节省表位疫苗开发所需的时间和成本,熟悉设计流程、熟练掌握相关计算机软件工具将为表位疫苗的有效研发带来有益帮助.     

Co60辐照聚苯乙烯微孔板的ELISA研究

为了探讨Co60γ射线辐照对聚苯乙烯微孔板吸附小分子多肽的影响,建立了检测HIV(人类免疫缺陷病毒)抗体的间接酶联免疫法(ELISA).分别用未经辐照处理、经紫外线(UV)辐照处理和经Co60辐照处理的聚苯乙烯微孔板吸附重组HIV抗原,再配以辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG,可以考察其灵敏度、特异性、均一性和稳定性等相关指标.实验结果表明:聚苯乙烯微孔板经Co60辐照(最优剂量为8×105rad)后,可明显改善酶联免疫法的测定效果,检测灵敏度和均一性均有显著提高.     

实时荧光定量PCR技术在人类细小病毒B19检测中的应用

人类微小病毒B19(Human parvovirus B19,HPV B19)是儿科常见的出疹性疾病——传染性红斑(又称第五病,Erythema infection,EI)的病因.除了这一轻型自限性感染外;B19病毒还可使慢性溶血病病人发生再障危象及急性多关节病.在免疫缺损病人中可造成持续性感染.由于细小病毒B19致病的广泛性和复杂性,目前国际上对该病毒的研究比较活跃.B19可通过呼吸道传播,也可通过输血和使用血液制品传播,从而引起多种疾病.B19病毒的近期感染主要通过IgM抗体的检测,常用捕获法或放射免疫测定,IgG抗体对诊断急性感染无意义,其存在仅表明曾感染过,主要用于血清流行病学调查.目前实验室和临床检测中,最敏感检测病毒的方法是PCR法,通过对B19进行实时荧光定量PCR检测,能突破窗口期的局限性,更利于B19病毒的早期诊断和治疗.本文,笔者根据荧光定量PCR的原理建立了人类细小病毒B19的实时荧光定量PCR检测方法,经过对临床样本的检测,显示建立的方法敏感性高,特异性好,适合B19病毒的筛查和核酸定量检测.     

奶牛病毒性腹泻-黏膜病毒(BVDV/MDV)病实证分析

采用酶联免疫吸附反应试验(ELISA),对南京某奶牛场的近期有流产史奶牛以及临场表现正常奶牛的血清进行BVDV及相应抗体的检测,再用反转录PCR(RT-PCR)技术对受感染奶牛所感染的BVDV类型进行分析。结果发现,该奶牛场近期有流产史奶牛BVDV重度感染,88个样本中,有84个检出BVDV,感染率高达97.62%,其中单独感染BVDV-Ⅰ(CP)型的比率有29.76%,单独感染BVDV-Ⅱ(NCP)型的比率为25%,同时感染两型的比率为42.86%。根据相对应的抗体检测结果发现有疑似持续感染(PI)牛存在。25个正常血清样本中,有8个样本检出携带有BVDV,且都是BVDV-Ⅰ(CP)型,与近期有流产史奶牛感染BVDV状况有明显差异,但由于正常血清样本数量过少,还需进一步深入研究。     

多窗口融合判别子空间的高光谱图像异常检测

由于高光谱图像异常检测受到不规则背景和噪声的干扰,直接应用传统的RX异常检测算法会造成很高的虚警和很大的运算量.针对这一问题,提出了一种基于判别子空间的结合多窗口融合的RX算法.首先在无先验信息的前提下采用聚类的方式得到样本类别,并对占优聚类样本进行判别特征提取;然后利用正交子空间投影使背景和目标信息达到最大程度的分离以实现对背景的抑制,从而在抑制背景的基础上利用局部多窗口融合的RX算法进行异常检测;最后将AUC值作为评价检测方法性能的指标. NUANCE和HYDICE高光谱数据异常目标检测实验的AUC值统计结果表明:多窗口融合算法在检测性能方面优于经典的全局和局部RX算法,它对背景和噪声有更强的抑制作用,且检测到的异常目标精确,可见该算法是有效而可行的.     

游泳运动对胰岛素抵抗大鼠血清炎性细胞因子的影响研究

研究游泳运动对RBP4诱导的胰岛素抵抗大鼠血清炎性细胞因子及免疫的影响。8周龄雄性SD大鼠腹腔注射3μg·g-1体重的重组RBP4,每天2次,每次间隔12 h,总共持续注射6周。设RBP4运动组(RE)、RBP4安静组(RR)和正常安静对照组(C),RE组给予6周无负重游泳训练,60 min·d-1。运用双抗体夹心酶标免疫分析法测定RBP4;免疫印迹法检测胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);TUNEL法标记各组大鼠胸腺的凋亡细胞;ELISA检测血清IL-6的含量;双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清GM-CSF含量。RE组血清RBP4和HOMA-IR显著低于RR组(P0.01);RE组胸腺细胞凋亡相对RR组减少;RE组与RR组大鼠血清IL-6含量降低(P0.01),但RR组中血清IL-6和血清GM-CSF的含量显著地高于C组(P0.01);IL-6、GM-CSF与HOMA-IR皆呈中度正相关。     

PCR扩增HBV x基因特征序列检测乙肝病毒DNA

提出了通过扩增特征序列检测乙肝病毒DNA的新方法．根据乙肝病毒DNA保守区的特点,利用Primer Premier 5.0设计出乙肝病毒x基因的特异性引物,并在以血清DNA为模板的聚合酶链反应体系中进行扩增,由此检测待测血清中是否存在乙肝病毒DNA．实验结果表明,该方法较传统的酶联免疫法灵敏,可以检测出酶联免疫法所检测不到的乙肝病毒,具有与免疫印迹一样的准确度;通过与以乙肝病毒s基因为靶序列的PCR反应体系比较,发现乙肝病毒x基因比s基因在序列上更为保守,更适合做乙肝病毒DNA检测的特征序列．