黑色素对λ溶原菌及其紫外线诱导性的影响

利用嗜麦芽假单胞菌１３５制备的Ｌ－多巴黑色素对溶原菌Ｅ．ｃｏｌｉ（λ）及其紫外线诱导性的影响进行了研究,结果表明,这种黑色素对该溶原菌的生长无影响,也不诱导形成λ噬菌体颗粒,但对该溶原菌的紫外线致死作用具有保护效应,０．９ｇ／Ｌ黑色素的保护效应近似于１００％;黑色素对溶原菌的紫外线诱导性有抑制效应或增强效应,０．３ｇ／Ｌ黑色素对溶原菌的紫外线诱导性的抑制效应最好。     

λ噬菌体切除酶基因Xis在大肠杆菌中的可溶性融合表达

λ噬菌体切除酶Xis(excisionase)是调控λ噬菌体溶源裂解转换过程中的一种重要蛋白质.通过密码子优化及两步法将来自λ噬菌体切除酶基因Xis在体外合成,然后克隆到带有类泛素蛋白SUMO标签的定向原核表达载体SUMO-p ETG上,测序正确后,然后转化至E.coli BL21(DE3)细胞可溶性表达.经SDS-PAGE及质谱检测证实表达蛋白确实为目的蛋白.该研究通过融合表达λ噬菌体切除酶Xis不仅解除了Xis对E.coli宿主细胞的毒害作用,而且实现在E.coli中的高水平可溶性表达.因此,Xis的大量制备,将会促进Gateway克隆技术的广泛应用.     

用PCR法检测苏云金杆菌的溶原性噬菌体

根据苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,B.t)溶原性噬菌体G IL01(GenBank Accession Number:AJ536703)的同源序列设计一对引物,用35株B.t标准菌株和生产菌株MZ1(血清型H3 a3b)的过夜培养物作模板,结果有16株菌株包括MZ1能扩增出大小约为750 bp的预期产物,推测这16株菌为溶原菌。MZ1菌株的过夜培养液与指示菌ZK1(血清型H25)混匀并在双层琼脂上培养12 h后出现了滴度为2×107pfu的噬菌斑,从而证明生产菌株MZ1确为溶原菌;又以G IL01同源性较高的其它四个基因设计引物,分别以MZ1的培养物及其溶原性噬菌体基因组为模板进行PCR扩增,结果两者得到几乎一致的带型,进一步证明了生产菌株MZ1为溶原菌,说明利用PCR法检测鉴定苏云金杆菌的溶原性是可行的。比较指示菌方法、直接电镜法和DNA鉴定法,PCR法快速简便,对B.t生产上快速检测其溶原性噬菌体有实用意义。     

λ噬菌体操纵基因和调控蛋白相互作用网络及溶原态/裂解态转变特性的动力学研究

根据大肠杆菌中λ噬菌体操纵基因与调控蛋白相互作用特点,提出操纵基因与调控蛋白相互作用模型.利用动力学方法,得到了两种调控蛋白浓度随时间变化的关系和在一定的时间范围内两种调控蛋白之间的关系,并且得到调控系统的稳态性质,进而分析调控系统溶原态/裂解态的转变特性.     

枯草杆菌纤溶酶基因的克隆及表达

为了提高豆豉纤溶酶(DFE)的表达产量,采用PCR方法从高纤溶活性的枯草芽孢杆菌DC12的基因组中扩增获得DFE基因,将含有启动子至3非翻译区的全长1400 bp基因插入大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pBE3,构建了DFE基因的表达质粒,化学转化枯草杆菌WB800获得了DFE的重组表达菌.试验结果表明:DFE基因在自身启动子驱动下,在蛋白酶缺陷型的枯草杆菌中获得了高活性的分泌表达;重组表达菌株培养30 h后,培养物上清液中的纤溶酶活性最高可达690U/mL.     

基因克隆中常用的一些载体及其特征

以大肠杆菌菌株为受体的基因克隆载体通常是由质粒、噬菌体DNA及柯斯质粒DNA纯化和构建的,近年来由这三类DNA构建的大量载体已广泛地应用于基因重组、克隆及表达系统中,在理论研究和生产实践上取得了重大突破和可观的效益,本文就近年来的一些进展做一代表性的介绍。1 噬菌体载体1.1 λgt10由λDNA纯化出来, 这种载体在λ抑制基因(CI)内含有一个EcoRI位点,能接受长     

一株新铜绿假单胞菌噬菌体SRT6的分离以及全基因组序列分析

分离一株新铜绿假单胞菌噬菌体,进行生物学特征分析,全基因组测序和比较基因组学分析.了解该噬菌体与其他假单胞菌噬菌体之间的亲缘关系以及它的潜在应用价值.利用双层平板法分离纯化噬菌体,利用酚氯仿抽提基因组,利用Illumina Hiseq测序平台对基因组测序,利用生物信息学进行基因组和比较基因组学分析.分离到一株新的烈性铜绿假单胞菌噬菌体SRT6,其基因组全长91 364bp,G+C含量49.3%,存在182个蛋白质编码基因,其中的96个与已知功能的蛋白质具有相似性,无tRNA和tmRNA.比较基因组分析发现,噬菌体SRT6属于一个新物种.分离鉴定出一株烈性铜绿假单胞菌噬菌体SRT6,并发现它属于一个新种噬菌体,为未来利用噬菌体治疗耐药铜绿假单胞菌感染打下坚实的基础.     

结核分枝杆菌噬菌体末端酶TerL的结晶化初步研究

结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病,临床应用的抗结核药物有很多,但耐药性结核菌的出现使得新的治疗方法,如噬菌体疗法越来越受重视.结核菌噬菌体是一种DNA病毒,它能够启动细菌细胞壁的溶解过程,裂解分枝杆菌,从而最终摧毁宿主菌,达到治疗效果.结核菌噬菌体末端酶在DNA包装过程中特异性地切割DNA连环体,通过产生成熟的病毒DNA而参与基因组包装,对末端酶的研究有助于对噬菌体疗法的分子机制进行进一步的探索.以噬菌体SWU1基因组中末端酶的大亚基的基因Ter L为模板,构建了重组载体,再经过在大肠杆菌中异源表达,获得目的蛋白后,利用一系列的纯化手段,得到了大量表达的高纯度的Ter L蛋白,并通过结晶条件的尝试,得到了其晶体,为末端酶Ter L结构的解析和功能的分析奠定了基础.     

解淀粉芽孢杆菌α—淀粉酶基因的分子克隆及其在大肠杆菌中表达的初步研究

以大肠杆菌噬菌体λEMBL_3为载体克隆了解淀粉芽孢杆菌的α—淀粉酶基因。被克隆的α—淀粉酶基因能够稳定存在,并可以在E.Coli中表达。携有α—淀粉酶基因的重组体噬菌体λPAmy~(13)其高效价裂解酶活力可达14.0u/ml。在大肠杆菌中产生的α—淀粉酶与兔抗解淀粉芽孢杆菌α—淀粉酶血清有交叉免疫反应。但与解淀粉芽孢杆菌本身所产生的α—淀粉相比,其免疫反应的程度下降。     

水稻16kDa醇溶蛋白启动子克隆及载体构建

水稻种子16 kDa醇溶蛋白是水稻种子成熟过程中,由16 kDa基因编码,16 kDa醇溶蛋白启动子调控,在胚乳中特异表达的蛋白质.以水稻基因组DNA为模板,通过PCR扩增技术得到16 kDa启动子片段,序列分析结果表明:获得的启动子片段的大小为931 bp,与已报道的该启动子序列相比较,其核苷酸序列同源性为99.9%.该启动子区域含有TATA-box,CAAT-box,GCN4基序,Prolamin-box等胚乳特异表达启动子所必需的正调控元件.利用该启动子构建了植物种子特异表达载体pC16 kDP.     

栖热菌噬菌体TSP4密码子偏嗜性及其对基因异源表达的影响

 为了探索噬菌体TSP4、栖热菌模式菌株Thermus thermophilus HB27中6种蛋白编码序列和Escherichia coli基因组遗传密码子使用偏嗜性,探索TSP4基因密码子偏嗜性对其基因异源表达的影响本研究利用生物学软件Editseq和RSCU算法统计噬菌体TSP4密码子使用频率并分析其偏嗜性,与栖热菌HB27的同源基因以及常温菌E.coli基因组的密码子使用偏嗜性进行对比分析.结果显示,噬菌体TSP4与栖热菌HB27优势密码子相似度高达85%,而与E.coli的相似性仅有65%.为了验证分析结果,选取TSP4基因组中一个潜在分子伴侣基因序列在E.coli BL21和E.coli Rosetta(补充了BL21菌株中缺失的6个稀有密码子)中进行异源表达.噬菌体TSP4与其宿主菌HB27之间密码子高相似性说明在长期的进化过程中TSP4在基因水平上形成对宿主的一种适应性机制.异源表达结果显示,分子伴侣基因在E.coli BL21中未见明显表达,但在Rosetta中高效表达,说明Rosetta中补充的 6个稀有密码子明显有助于分子伴侣基因的表达,该结果也进一步证明密码子偏嗜性是否一致在很大程度上影响基因的表达.     

人源噬菌体抗体库的构建及抗D-二聚体抗体的获得

目前国际和国内筛选蛋白所用的技术主要是噬菌体展示技术和酵母双杂交技术。噬菌体展示技术在抗体的筛选方面已显示出良好的应用前景。本实验应用噬菌体展示技术展示出血栓病人的抗体，形成对血栓病人的抗体库。并从中淘选出能与血栓降解产物之一的D-二聚体有特异结合作用的抗体Fabp13。抗D-二聚体的Fab在XL1-Blue中得到可溶表达。再利用抗D-二聚体抗体进行竞争ELISA检验，证实p13具有抗D-二聚体的活性。从而我们筛选得到了抗D-二聚体抗体Fab p13。     

大肠杆菌ppsA,pckA基因的克隆与串联表达

磷酸烯醇丙酮酸合成酶（ppsA)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（pckA）是糖代谢中心途径中生成磷酸烯醇丙酮酸（PEP）的2个关键酶，在大肠杆菌中分别由ppsA和pckA基因编码，首先用PCR方法从大肠杆菌K12菌株基因组DNA扩增得到了ppsA和pckA基因，并将ppsA,pckA以单独或串联的方式克隆到大肠杆菌表达质粒pλPR上，构建成的质粒pλPR-ppsA,pλPR-pckA,pλPR-ppsA-PckA导入E.coli P2392菌株中表达，结果表明，ppsA,pckA基因的单独表达使宿主细胞的ppsA和pckA酶活力分别提高到5．2和2．5倍，串联表达使宿主细胞PAt和PckA酶活力分别提高到3．1和2．3倍，还使得以PEP为底物合成的3－脱氧α－阿拉伯 酮糖－7－磷酸（DAHP）产量提高到2．1倍，2个基因串联表达比单个基因表达更有利于提高DAHP的产量。     

λ噬菌体调节蛋白与操纵基因相互作用的研究

根据λ噬菌体调节蛋白和特异的ＤＮＡ部位的相互作用提出一种线笥三位点的结合模型，从理论上解释了调节蛋白结合左右操纵基因的协同性，得出耦合自由能的分配。     

一株新型溶藻弧菌噬菌体φV039C的生物学特性和全基因组分析

对一株溶藻弧菌噬菌体φV039C进行了生物学特性和全基因组序列的研究。经透射电镜观察可见,噬菌体φV039C头部为正廿面体结构,直径58.9 nm,具长105.2 nm的尾部;采用双层平板法检测,其最佳感染复数为0.1;通过一步生长曲线计算可得,噬菌体φV039C的潜伏期为20 min,爆发期为10 min,裂解量为163 pfu/cell;利用第三代单分子测序平台进行全基因组测序分析,其基因组全长43 405 bp,G+C含量为42.95%,74个开放阅读框（ORF）主要为噬菌体的结构、DNA复制和裂解有关的基因;在NCBI数据库中进行基因组比对,发现与其最接近的长尾噬菌体科的溶藻弧菌噬菌体NF和副溶血弧菌噬菌体Seahorse的覆盖率仅为11%（覆盖区域的相似度分别为92.2%和93.3%）,此外,基于裂解酶构建的系统进化树也表明,φV039C与二者处于距离最近的分支。由此得出,溶藻弧菌噬菌体φV039C是一株新型的噬菌体,分类上应归属有尾噬菌体目长尾噬菌体科。     

抑制铜绿假单胞菌生长的噬菌体K4基因的筛选

噬菌体基因组携带多种影响宿主菌生长的基因,是筛选新型抗菌素的可能靶位.本研究分别克隆铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)噬菌体K4携带的全部75个基因,在阿拉伯糖启动子控制下进行表达.实验结果表明,6个噬菌体基因的表达产物能够显著抑制宿主菌的生长.生物信息学分析显示,基因gp72编码的末端酶大亚基与噬菌体基因组包装过程相关,基因gp49编码假定的5′-3′核酸外切酶,其余4个基因编码产物未发现特定的蛋白结构域.利用脉冲场凝胶电泳分析宿主菌染色体DNA的完整性,在阿拉伯糖诱导5,h时,蛋白Gp17、Gp41、Gp72、Gp29和Gp49能够导致宿主菌染色体DNA的显著降解,这是抑制宿主菌生长的可能原因.蛋白Gp67对宿主菌染色体DNA没有影响,其抑制细胞生长的机制不同于其他蛋白.实验还发现,筛选基因的产物还能影响噬菌体的感染效率.本研究发现的抑制细菌生长的基因,能够为筛选新型抗菌素提供新的靶位.     

家兔基因文库的建立

根据鸟枪法克隆基因的原则，建立了家兔总ＤＮＡ文库。为适应同位素标记探针法克隆筛选方法，建立了以人噬菌体为载体的文库。每个重组子携家兔基因组ＤＮＡ平均２０ｋｂ，共获重组噬菌体达１０＾６。以人生长激素ｃＤＮＡ为探针，采用噬菌斑原位杂交、斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交等操作，对以噬菌体为载体的文库进行了筛选和有效性验证。结果表明：（１）人生长激素与兔生长激素的ＤＮＡ存在相当的同源性，以人生长激素ｃＤＮＡ     

谷氨酸发酵噬菌体研究初报

噬菌体污染,常给谷氨酸发酵造成严重危害,所以查明系外源噬菌体的污染或溶原菌诱导出的噬菌体污染,就成了人们关注的首要问题。我们从谷氨酸生产菌北京棒状杆菌突变株——FM820-7紫外线、丝裂霉素C诱导分离到二株噬菌体526,528,从FM820-7菌株生产环境样品中分离到一株噬菌体530,对分离的噬菌体形态及生物学特性进行了初步研究。并就溶原菌株诱导方式、噬菌体的检测实验条件进行了探讨,为迅速澄清污染源,提供了直接有效的手段。     

小鼠凝血因子Ⅸ基因组DNA的结构分析和ES细胞基因打靶研究

为了利用ＥＳ细胞基因打靶技术建立人血友病Ｂ的转基因小鼠模型，用小鼠ＦＩＸ基因ｃＤＮＡ为探针，筛选１２９Ｓｖ小鼠的基因组ＤＮＡ噬菌体文库，从２＊１０＾５个噬斑中得到５个独立的阳性噬菌体克隆。     

大肠杆菌pheA与tyrB基因的克隆与串联表达

为探讨用基因工程的手段改良苯丙氨酸的发酵菌株，采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）的方法，从大肠杆菌总ＤＮＡ中克隆得到了编码苯丙氨酸合成途中的两个关键酶基因－即分枝酸变位酶（ＣＭ）／预苯酸脱水酶（ＰＤ）基因ｐｈｅＡ与苯丙氨酸转氨酶（ＰＡＴ）基因ｔｙｒＢ，在大肠杆菌中进行了这两个基因的单个和串联表达。ｐｈｅＡ和ｔｙｒＢ基因分别都能在λ噬菌体的ＰＲ启动子之后得到较大量的表达，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现清晰的条带，