低氧训练诱导骨骼肌细胞球蛋白、脑红蛋白和缺氧诱导因子-1α表达

选用健康雄性SD大鼠,应用实时荧光定量PCR法,观察不同训练条件下大鼠骨骼肌缺氧诱导因子-lα(HIF-1α)、细胞球蛋白、脑红蛋白基因表达变化.结果表明:低氧训练可增加骨骼肌HIF-lα和细胞球蛋白、脑红蛋白mRNA含量,骨骼肌组织HIF-lα表达的增加对细胞球蛋白基因表达具有促进作用.     

HIF-1α对宫颈癌细胞迁移能力的影响

将表达野生型HIF-1α(fl HIF-1α)和抑制性HIF-1α(dn HIF-1α)的重组质粒pcDNA3.1-fl HIF-1α和pcDNA3.1dn HIF-1α转染入SiHa细胞中表达,采用免疫细胞化学法和Western blot检测重组质粒转染SiHa细胞后其HIF-1α与CXCR4表达水平的变化;划痕试验测定细胞迁移情况,同时与pcDNA3.1组和未转染组进行比较.结果重组质粒pcDNA3.1fl HIF-1α和pcDNA3.1dn HIF-1α转染SiHa细胞后,pcDNA3.1-fl HIF-1α转染组(fl组)HIF-1α蛋白表达水平与其他三组比显著增高,差异具有统计学意义(P＜0.05),而pcDNA3.1dn HIF-1α转染组(dn组)与pcDNA3.1组和未转染组相比无统计学差异(P＞0.05).但fl组和dn组其CXCR4蛋白水平的表达与pcDNA3.1组和未转染组相比均有较明显的差异(P＜0.05).fl组迁移能力略高于对照组(P＞0.05),dn组迁移能力明显低于对照组(P＜0.05).HIF-1α能提高CXCR4蛋白的表达,从而加快SiHa细胞的迁移;而dn HIF-1α的作用正好相反.     

大鼠急性心肌缺血死亡后心肌HIF-1α、Egr-1 mRNA的表达

目的研究大鼠心肌缺血死亡后不同时间点HIF-1α及Egr-1mRNA的表达规律，为因急性心肌缺血死亡的法医学诊断提供客观依据。方法建立SD大鼠急性心肌缺血模型。随机将大鼠分为正常对照组、假手术组、急性心肌缺血试验组。采用免疫组织化学、RT—PCR死亡不同时间点大鼠心肌点HIF-1α及Egr-1mRNA的表达规律。结果大鼠心肌结扎1h缺血心肌中HIF-1α及Egr-1mRNA明显表达，随着死后时间的延长，表达降低，至术后96h仍可测到；正常对照组与假手术组均未测到HIF—1α及Egr-1mRNA表达。结论HIF—1α及Egr-1mRNA可作为诊断因急性心肌缺血死亡的敏感指标。     

高糖、低氧对大鼠心肌微血管内皮细胞新生功能影响的体外研究

目的:探讨高糖、低氧对大鼠心肌微血管内皮细胞(CMEC)新生功能的影响.方法:体外培养成年大鼠CMEC,随机分为4组:正常对照组(NG组)、高糖组(HG组)、低氧组(HNG组)和高糖+低氧联合组(HHG组).Real-time PCR法检测各组CMEC的HIF-1α、VEGF的mRNA表达水平; CCK-8法检测各组CMEC的体外增殖能力;transwell小室实验评价各组CMEC的迁移能力;体外小管形成实验评价各组CMEC的成管能力.结果:(1) HIF-1α的mRNA表达水平:NG组与HG组之间、HNG组与HHG组之间无统计学差异(P 0. 05); HNG组明显高于NG组(P 0. 05),HHG组明显高于HG组(P 0. 05),表明低氧可促进CMEC的HIF-1αmRNA表达. VEGF的mRNA表达水平:NG组与HG组间无统计学差异(P 0. 05),HNG组明显高于HHG组(P 0. 05); HNG组明显高于NG组(P 0. 05),HHG组明显高于HG组(P 0. 05),表明高糖可抑制CMEC的VEGF mRNA表达,而低氧可促进其表达.(2)细胞的增殖能力:NG组明显高于HG组(P 0. 05),HNG组明显高于HHG组(P 0. 05); NG组明显高于HNG组(P 0. 05),HG组明显高于HHG组(P 0. 05),表明高糖、低氧均可抑制CMEC增殖.(3)细胞的迁移能力:NG组明显高于HG组(P 0. 05),HNG组明显高于HHG组(P 0. 05); NG组明显高于HNG组(P 0. 05),HG组明显高于HHG组(P 0. 05),表明高糖、低氧均可抑制CMEC迁移.(4)细胞的成管能力:NG组明显高于HG组(P 0. 05),HNG组明显高于HHG组(P 0. 05); NG组明显高于HNG组(P 0. 05),HG组明显高于HHG组(P 0. 05),表明高糖、低氧均可抑制CMEC小管形成能力.结论:高糖对CMEC的HIF-1αmRNA表达的影响不明显,但可明显抑制CMEC的VEGF mRNA表达;低氧可促进CMEC的HIF-1α和VEGF mRNA表达;高糖和低氧均可降低CMEC的增殖能力、迁移能力和成管能力,两者联合时作用更为明显.     

抗HIF-1αmRNA锤头状核酶的计算机设计

设计一个抗缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）mRNA的锤头状核酶为构建它的基因表达载体选择靶点，以便用于肿瘤的基因治疗。从GenBank寻找缺氧诱导因子-1αmRNA的全序列，用RNA结构分析软件预测HIF—1αmRNA的二级结构并选择合适的核酶作用靶点，从而设计相应的锤头状核酶。HIF-1αmRNA的577位含有GUC三联体，可以作为核酶的切割靶点，设计的核酶包括22nt的催化活性中心和16nt的侧翼序列。计算机辅助预测证明此位点为合适的靶点，用Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）筛选以确定的靶点序列的唯一性。成功设计抗HIF—1αmRNA锤头状核酶基因表达载体，为进一步运用核酶切割HIF—1αmRNA基因来抑制肿瘤生长铺平了道路。     

大鼠精索静脉曲张对睾丸生精细胞Cx43表达的影响

目的探讨精索静脉曲张(VC)对青春期大鼠睾丸生精细胞Cx43的影响.方法部分结扎大鼠左肾静脉,建立精索静脉曲张模型.取雄性SD大鼠30只,随机分为2组,每组15只,分为对照组、精索静脉曲张组(手术组),每组中再分为3个亚组,每组5只,结扎持续时间为2,4,8周;达到相应的时间段后取各组大鼠左侧的睾丸,运用RT-PCR法检测Cx43及HIF-1α基因的表达,并在8周时通过Western-blot法检测Cx43及bcl-2蛋白表达水平.结果对照组在2,4,6周时Cx43及HIF-1α基因表达无明显变化;手术组在2,4,6周时HIF-1α基因表达水平提高,Cx43基因表达水平下降,与对照组相比,差异具有统计学意义(P0.05);蛋白检测结果表明:8周时手术组Cx43及bcl-2蛋白表达水平显著下降.结论精索静脉曲张可致大鼠睾丸组织缺氧,Cx43及bcl-2表达下调,并诱导睾丸组织生精细胞凋亡增加,进而影响睾丸生精功能.     

Ad-HIF-1α双突变体对大鼠缺血心肌及Na~+-K~+ ATP酶的影响

目的:研究重组腺病毒低氧诱导因子-1α双突变体基因对心肌梗死大鼠缺血心肌损伤程度及Na~+-K~+ATP酶的影响.方法:36只雄性SD大鼠建立急性心肌梗死模型,随机分成3组,分别为生理盐水组(Saline组,n=12)、腺病毒空载体组(Ad-Null组,n=12)、Ad-HIF-1α-564/402组(n=12).在术后即刻分别肌注生理盐水、AdNull、Ad-HIF-1α-564/402 0.1 m L,病毒滴度1.0×108PFU.术后7 d,记录大鼠24 h饮食量、饮水量及体质量,观察大鼠的精神及运动状况.检测血清中肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白I、B型利钠肽浓度.进行血流动力学检测,测量左室收缩压、左室舒张末压、左室最大上升/下降速率.采用分光光度计法检测心肌梗死大鼠心肌Na~+-K~+ATP酶水平.结果:基因转染后7 d,3组大鼠饮食量、饮水量、体质量无统计学差异.Ad-HIF-1α-564/402组大鼠较Saline组、AdNull组反应更为灵敏,活动耐量增加.CK-Mb、c Tn I、BNP血清浓度在Ad-HIF-1α564/402组均较其他两组为低,3组间有统计学差异(P0.05).Ad-HIF-1α-564/402组大鼠LVSP、±LVdp/dtmax明显高于Saline组、Ad-Null组(P0.05).Ad-HIF-1α-564/402组大鼠LVEDP明显高于Saline组、Ad-Null组(P0.05),上述指标Saline组、Ad-Null组均无统计学差异(P0.05).分光光度计结果显示:Na~+-K~+ATP酶水平3组间无统计学差异(P0.05).结论:AdHIF-1α-564/402能减轻心肌细胞梗死程度,保护心脏功能,对Na~+-K~+ATP酶水平无明显影响.     

山慈菇正丁醇提取物对NR8383细胞分泌的IL-1β和TNF-α水平的影响

为了探讨山慈菇正丁醇提取物对NR8383细胞(大鼠肺泡巨噬细胞)分泌的白介素-1β(interleukin-1,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平的影响,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)法检测TNF-α和IL-1β的mRNA水平,利用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测细胞上清液中TNF-α和IL-1β的蛋白含量。结果显示:与空白对照组相比,终浓度1. 25 mg/m L的山慈菇正丁醇提取物可极显著降低R8383细胞分泌TNF-αmRNA水平和蛋白含量(P 0. 01);与空白对照组相比,终浓度1. 25 mg/m L山慈菇正丁醇提取物能极显著升高IL-1β的mRNA水平和蛋白含量(P 0. 01),同时0. 012 5 mg/m L山慈菇正丁醇提取物能极显著降低IL-1β的mRNA水平和蛋白含量(P 0. 01)。说明终浓度为1. 25 mg/m L的山慈菇正丁醇提取物可极显著调控NR8383细胞分泌的TNF-α和IL-1β的基因和蛋白含量。     

HIF-1α表达对人乳腺癌细胞侵袭转移能力的影响

为研究缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在人乳腺癌细胞中的表达及其与乳腺癌细胞侵袭转移能力的相关性,采用在培养基中加入CoCl2模拟化学缺氧培养细胞,RT—PCR和Western-blot、免疫细胞化学检测HIF-1α在人乳腺癌细胞MCF-7和MDA—MB-231中mRNA水平和蛋白质水平在缺氧前后的表达差异,及Millicell小室人工重组基底膜侵袭迁移实验检测缺氧前后两株细胞侵袭迁移能力的改变．结果发现：缺氧后,两株细胞的HIF-1α mRNA水平和蛋白质水平均较缺氧前增高（p〈0．01）,MDA—MB-231和MCF-7之间有显著差异（p〈0．01）;MDA—MB-231的侵袭转移能力明显增加（p〈0．01）,MCF-7的侵袭转移能力略有增加（p〈0．05）．表明缺氧上调HIF-1α转录及蛋白表达,进而促进乳腺癌细胞的侵袭转移能力．     

SDF-1α改善高糖对骨髓间充质干细胞存活及迁移能力的抑制作用与分子机制的研究

目的:探讨基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)对高糖环境(25 mmol/L)下大鼠骨髓间充质干细胞(r MSCs)存活及迁移能力的影响及相关分子机制.方法:采用全髓贴壁法纯化培养r MSCs,通过MTT法检测细胞增殖率、Hoechst 33258染色从形态学角度观察细胞凋亡评估SDF-1α对高糖环境下r MSCs存活的影响,同时通过transwell实验评估SDF-1α对高糖环境下r MSCs细胞迁移能力的影响.结果:实验结果发现,与低糖培养液(5.6mmol/L)比较,高糖培养液可明显抑制r MSCs增殖、促进细胞凋亡(P0.05),SDF-1α(50 ng/m L)可减轻高糖培养液对细胞增殖的抑制及诱导细胞凋亡的作用(P0.05),CXCR4受体特异性拮抗剂AMD3100(10μg/m L)虽能进一步抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡,但差异无显著性(P0.05).Transwell实验发现高糖培养液可明显抑制r MSCs的迁移作用(P0.05),SDF-1α(50 ng/m L)可逆转高糖培养液对细胞迁移的抑制作用(P0.05),AMD3100(10μg/m L)可进一步抑制细胞迁移,且差异有显著性(P0.05).结论:SDF-1α可能通过CXCR4受体改善高糖对骨髓间充质干细胞迁移能力的抑制,而其改善高糖对骨髓间充质干细胞存活的抑制则可能通过非CXCR4受体介导,为改善MSCs用于治疗冠心病合并糖代谢异常患者心梗后心力衰竭疗效进一步提供理论依据.     

肽-DNA纳米颗粒用于HIF-1αΔODD转染脊髓损伤动物模型的研究

为了探讨肽-DNA纳米颗粒技术用于转染脊髓损伤动物模型的可能性,本研究在克隆得到氧浓度非敏感性的HIF-1α突变体基因(HIF-1αΔODD)并构建其真核重组表达载体(pEGFPC1-HIF-1αΔODD)的基础上,构建用于转染动物模型的肽-DNA纳米颗粒,将其转染脊髓损伤大鼠模型,用组织免疫荧光方法检测内/外源性HIF-1α在动物模型中的表达情况.结果显示,外源性HIF-1α在实验组脊髓组织中正确表达,说明构建的pEGFPC1-HIF-1αΔODD的肽-DNA纳米颗粒成功转染了稳定的脊髓损伤大鼠模型,肽-DNA纳米颗粒技术可作为中枢神经系统损伤动物模型的分子干预研究的一种新的选择.     

pEZsiRNA6.1/hHif-1α稳定转染食管鳞癌EC-9706细胞系的建立

利用基因工程技术将合成的HIF-1α shRNA与pEZsiRNA6.1空载体连接,构建pEZsiRNA6.1/hHif-1α载体,PCR和测序结果表明所构建的pEZsiRNA6.1/hHif-1α重组载体正确.进一步将所构建的载体转染人食管鳞癌EC-9706细胞系,利用G418筛选HIF-1α稳定干扰的细胞系,荧光显微镜检测结果表明：稳定转染pEZsiRNA6.1/hHif-1α的EC-9706细胞均有绿色荧光蛋白示踪.经CoCl2诱导模拟缺氧4 h,Western Blot结果显示pEZsiRNA6.1/hHif-1α能有效抑制EC-9706缺氧食管癌细胞HIF-1α的诱导表达.     

白介素-38在活动期系统性红斑狼疮患者中的表达及与IKKβ激酶的关系

目的:研究活动期系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血中白介素-38(IL-38)和IKKβ激酶的表达水平,以探讨IL-38与IKKβ的关系.方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应检测IL-38、IKK基因表达水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IL-38、肿瘤坏死因子α(TNF-α)蛋白表达水平;采用t检验或Mann-Whitney秩和检验.结果:(1)活动期SLE患者IL-38 mRNA表达水平(0.36±0.09)显著低于正常对照组(1.00±0.17),差异有统计学意义(P0.01);活动期SLE患者IL-38蛋白表达水平(5.86±2.76)pg/mL显著低于正常对照组(18.48±1.35)pg/mL,差异有统计学意义(P0.05);(2)活动期SLE患者TNF-α表达水平(10.78±1.25)pg/mL显著高于正常对照组(4.34±0.69)pg/mL,差异有统计学意义(P0.05);(3)活动期SLE患者IKKβmRNA表达水平(6.01±1.51)显著高于正常对照组(1.16±0.14),差异有统计学意义(P0.05);(4)活动期SLE患者IL-38与TNF-α蛋白表达水平呈负相关,差异有统计学意义(P0.05);(5)活动期SLE患者IL-38与IKKβmRNA表达水平呈负相关,差异有统计学意义(P0.05).结论:活动期SLE患者IL-38基因及蛋白表达水平下降,并且与TNF-α和IKKβ水平呈负相关,推测在SLE患者体内IL-38水平下降,促进TNF-α和IKKβ的高表达,从而活化核因子-κB(NF-κB)信号通路,参与了SLE的发病.     

大丁草（Gerbera anandria（L．）Sch Bip．）对腺嘌呤诱导的慢性肾功能衰竭大鼠TGF—β1和ET-1mRNA表达的影响

采用Wistar大鼠灌胃腺嘌呤4周复制慢性肾衰模型后用大丁草水煎液进行灌胃治疗,4周后检测各组肾功能、肾脏组织病理学改变及转化生长因子-β1(TGF-β1)和内皮素-1(ET-1)mRNA的表达结果发现大草组大鼠血肌酐和尿素氮浓度分别为(89.33±15.21),μmol/L和(21.52±3.95)mmol/L与治疗前的建模组(290.33±74.55)μmol/L和(32.30±2.35)mmol/L以及病理对照组(149.67±24.95)μmol/L和(33.18±2.95)mmol/L比较有所下降,经统计P<0.05,差异具有显著性与病理对照组相比大丁草组大鼠基因TGF-β1和ET-1表达也明显降低,与看家基因GAPDH的比值分别由(0.2026±0.0503)和(0.1949±0.0969)下降为(0.1285±0.0447)和(0.07810±0.0229),经统计P<0.05,差异具有显著性.由此认为大丁草对腺嘌呤所致慢性肾功能衰竭大鼠肾脏有保护作用,其机制可能是通过抑制TGF-β1和ET-1的表达来缓解肾脏损伤,恢复肾功能.     

三七毛根皂苷对动脉粥样硬化大鼠血脂及血管细胞黏附分子表达影响

观察三七毛根皂苷（PNS）对实验性动脉粥样硬化（AS）大鼠血脂及血管细胞黏附分子-1（VCAM-1） mRNA表达的影响.采用高脂饲料配合腹腔维生素D3注射法建立AS大鼠模型,将Wistar大鼠随机分成正常对照组、模型组、PNS低剂量组、PNS高剂量组、阳性对照组.治疗4周后检测血脂水平、血清丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活力,分离主动脉,苏木素 伊红（Hematoxylin Eosin）染色及RT PCR技术检测主动脉VCAM l mRNA表达.模型组大鼠均出现血脂异常及主动脉病理形态改变.PNS低、高剂量组能降低TC,TG,LDL-c及MDA含量,升高HDL-c及SOD活力（P<0.01或P<0.05）,下调VCAM-l基因mRNA的表达（P<0.01）.表明PNS具有良好的抗AS作用,其下调相关基因VCAM-1 mRNA的表达可能是其产生治疗作用的分子机理之一.     

血清S100 B、HIF-1α、NGB、AQP7在缺血性脑卒中患者中的表达

目的 探讨血清S100B、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、脑红蛋白(NGB)、水通道蛋白7(AQP7)在缺血性脑卒中患者中的表达.方法 选择缺血性脑卒中患者366例,根据脑梗死体积分为小体积梗死组(<5 cm3)198例,中大体积梗死组(≥5 cm3)168例;根据静脉溶栓后24 h复查CT结果分为出血转化组82例,非出血转化组284例;静脉溶栓治疗前进行美国国立卫生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)评分,根据评分结果分为NIHSS评分≤15分组301例,NIHSS评分>15分组65例.记录患者的空腹血糖、收缩压、舒张压、溶栓时间窗;同时采集患者外周静脉血4 mL,应用Western blot法检测血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白表达水平.结果 中大体积梗死组患者NIHSS评分、收缩压、舒张压明显高于小体积梗死组,差异具有统计学意义(P<0.01);空腹血糖、溶栓时间窗在小体积梗死组与中大体积梗死组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).出血转化组患者NIHSS评分、空腹血糖、收缩压、舒张压、溶栓时间窗明显高于非出血转化组,差异具有统计学意义(P<0.01).中大体积梗死组患者血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白表达水平明显高于小体积梗死组,差异具有统计学意义(P<0.01).出血转化组患者血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白表达水平明显高于非出血转化组,差异具有统计学意义(P<0.01).NIHSS评分>15分组患者血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7蛋白表达水平明显高于NIHSS评分≤15分组,差异具有统计学意义(P<0.01).结论 血清S100B、HIF-1α、NGB、AQP7水平升高参与缺血性脑卒中患者梗死体积的扩大、静脉溶栓后出血转化、NIHSS评分升高,可用于对患者病情严重程度和静脉溶栓潜在出血风险的评估.     

血管生成素-1基因治疗兔心肌梗塞的实验观察

探讨血管生成素_1(Ang1)基因经重组腺病毒介导转移促进心肌缺血区血管形成的作用 .应用共转染 2 93细胞 ,制备纯化Ang1重组腺病毒及LacZ重组腺病毒 .将Ang1重组腺病毒及LacZ重组腺病毒直接注射感染兔冠状动脉结扎后缺血心肌细胞 ,分别应用RT_PCR方法及X_gal染色测定外源基因在转导心肌中的表达 ,用免疫组化及冠状动脉造影方法观察缺血心肌内血管生长及侧支循环形成的情况 ,并用心脏超声检查观测了注射Ang1重组腺病毒后心功能变化 .结果显示重组腺病毒直接注射感染兔缺血心肌后能有效表达目的基因 ,X_gal染色显示LacZ基因转移后第 3、7、14、2 8d注射部位心肌均见蓝染 ,尤以 7d明显 ,RT_PCR测定提示Ang1基因在转移后第 3d心肌中即有表达 ,7、14d仍呈阳性表达 .转移 2 8d后新生毛细血管密度及侧支循环形成明显高于对照组 (P <0 .0 1) .心肌梗塞发生后各组的心功能随时间延长均有所改善但 14d内各组间无明显差异 ,2 8d后Ang1组改善幅度明显高于对照组 (P <0 .0 1) .本实验表明腺病毒介导的Ang1基因在兔缺血心肌中能有效表达 ,促进新生血管形成 ,改善心脏功能 .     

空间辨别性学习记忆活动对大鼠海马齿状回SDF-1免疫阳性细胞的影响

目的:探讨空间辨别性学习记忆活动引致大鼠海马形态学可塑与海马齿状回内基质细胞衍生因子-1(SDF-1)表达的关系。方法:用水迷宫训练SD大鼠建立空间辨别性学习记忆模型,用免疫组化方法和图像分析技术检测大鼠海马齿状回SDF-1免疫阳性细胞的变化。结果:(1)对照组大鼠海马齿状回可见少量SDF-1免疫阳性细胞,阳性细胞胞体呈圆形或椭圆形,胞核较大,胞浆呈棕黄色。阳性细胞主要分布在齿状回颗粒细胞层;游水组大鼠海马齿状回SDF-1免疫阳性细胞的数量和形态与对照组的相比未见差异;模型组大鼠海马齿状回SDF-1免疫阳性细胞数量随着训练时间逐渐增多,细胞形态同对照组,胞浆呈深棕黄色,并有一至多个突起。(2)对照组与游水组7、14、21 d的大鼠海马齿状回SDF-1免疫阳性细胞在形态和数量未见统计学差异(P>0.05);对照组与模型组7、14 d大鼠海马齿状回SDF-1免疫阳性细胞的形态和数量未见统计学差异(P>0.05);模型21 d大鼠齿状回SDF-1免疫阳性细胞的形态和数量与对照组的比有明显统计学差异(P<0.01)。结论:大鼠海马齿状回内SDF-1阳性细胞可能参与空间辨别性学习记忆活动引致的形态学可塑性。     

BGC-823细胞中慢病毒途径针对HIF-1α基因的RNAi实验

目的：构建人HIF-1α基因的shRNA慢病毒载体、包装生产重组慢病毒颗粒,病毒途径高效感染胃癌细胞株BGC-823,并验证基因沉默效率。方法：在NCBI数据查找人HIF-1α基因序列,然后使用siRNA在线设计软件,设计针对基因CDS区的3条siRNA序列及Negative序列。根据设计好的siRNA序列设计双链互补的shRNA-Oligo DNA,退火形成双链后与线性化载体链接,构建shRNA重组表达载体。经由293TN细胞包装shRNA重组慢病毒颗粒,随后使用重组病毒感染BGC-823,通过荧光标记蛋白GFP确定感染效率后收集细胞样本,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果：shRNA重组表达载体测序结果与设计序列完全一致,包装病毒后滴度达到1×104 ifu/μL。慢病毒感染BGC-823细胞取得了极高的基因转导效率。mRNA检测结果显示,siRNA3对于对与目的基因的沉默效果最好,较阴性对照序列组相比较,mRNA的表达量下降了92%,Western blot检测的结果与mRNA检测结果完全相符合。结论：通过慢病毒途径,可以在BGC-823细胞中高效的进行HIF-1α基因的沉默。     

饥饿状态下HNF4α对MTP的表达调控

肝细胞核因子4α(HNF4α)是肝脏中一种重要的转录因子,其参与多个代谢途径的调控.微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP)是极低密度脂蛋白装配和分泌过程的限速酶.C57BL/6J小鼠中研究发现,饥饿可以诱导肝细胞MTP基因的表达.在HepG2细胞中进一步证实饥饿可以诱导MTP表达,同时HNF4α表达也显著上升.实验证实MTP是HNF4α的靶基因之一,用腺病毒介导的HNF4α过表达和HNF4α的激动剂均显著提高MTP的表达;HNF4α特异性siRNA抑制HNF4α的表达,MTP的mRNA和蛋白水平相应下调.结果证明,在饥饿状态下可以诱导MTP和HNF4α的表达,MTP的表达量上升是受到HNF4α的转录调控.