GP73糖基化修饰水平可为肝癌诊断提供进一步依据

 蛋白质糖基化主要包括N-连接糖基化、O-连接糖基化,是最常见的翻译后修饰之一。N-连接糖基化分为高甘露糖型、杂合型、复杂型3 种类型。N-糖链通过GlcNAc 与蛋白质上的天冬酰胺（Asn）连接,特征序列为Asn-X-Ser/Thr（X≠Pro）,N-糖链结构的共有结构是由2 个GlcNAc和3 个Man 所构成的五糖核心。     

糖苷合成酶及应用的研究进展

糖基化修饰不仅能改善生物大分子和化合物的理化性质如水溶性和稳定性,且有可能增强其原生物活性或赋予新活性。目前,提取分离、化学合成和酶法合成是糖基化修饰产物的主要来源,但前两种方法通常存在产物多样性不足、得率低或糖基化位点特异性差等难题。基于糖基转移酶和糖苷合成酶的酶法糖基化修饰技术则能够较好地解决上述两种方法存在的问题,并展现出一定优势。由于糖基转移酶已被多次综述,本文将概述糖苷合成酶的研究进展,为多功能新型糖苷合成酶的开发和应用提供参考和借鉴。     

OGT结构改造对糖探针GlcNAz利用率的影响

GlcNAz作为探针,可用于代谢标记细胞内O-GlcNAc修饰蛋白,帮助蛋白富集和后续质谱鉴定.但细胞内大量存在的天然糖供体 (UDP-GlcNAc) 会竞争结合OGT蛋白,从而降低 GlcNAz利用效率.为了提高GlcNAz利用率,在分子对接基础上,对OGT进行结构改造,构建了两种sOGT突变体(M130A、Y470A)并测定了它们对UDP-GlcNAz的利用率.与野生型sOGT相比,两种突变体对UDP-GlcNAz的利用率 (相对于UDP-GlcNAc)均有显著提高,细胞内 M130A 对 GlcNAz 的利用率(相对于 GlcNAc)提高了 2.2 倍 . 最终结果表明:M130A能显著提高细胞对探针GlcNAz的利用率,为大量鉴定细胞内O-GlcNAc修饰蛋白提供了新思路.     

O-GlcNAc化多肽的合成

O-GlcNAc是最常见的翻译后修饰之一,几乎在从原始细菌到哺乳动物和植物的所有的生物系统中都能发现.应用固相方法合成了糖基化修饰的多肽R4,得到的反应中间体和最终产物通过电喷雾质谱(ESI·MS)鉴定.     

Neuritin结构组成分析及其相互作用蛋白生物信息学预测

目的 对Neuritin的理化性质及结构组成，蛋白质相互作用网络进行生物信息学预测分析，为进一步研究Neuritin的功能和作用机制提供新的思路与方向。方法 应用Protscale和ProtParam、TMHMM、SignalP、PSORTⅡ、NetNGlyc、NetOGlyc和Netphos等软件，分析Neuritin的理化性质、跨膜结构、信号肽结构、亚细胞定位以及翻译后修饰位点；利用Protean、tFold以及AlaphFold等软件和数据库，分析Neuritin的二级和三级结构；同时，利用STRING数据库构建Neuritin蛋白质相互作用网络。结果 Neuritin的相对分子质量为15 332.77,理论等电点(PI)为6.54。不稳定系数27.26,属于较稳定蛋白；脂肪系数98.31;总平均亲水性0.208,属于疏水性蛋白；Neuritin表达产物N端27个氨基酸为信号肽，C端27个氨基酸为GPI锚定序列，为跨膜区；其亚细胞定位及可能性分别为胞外(34.8%)、细胞膜(34.8%)、内质网(17.4%)及高尔基体(13.0%);无N糖基化及O糖基化位点，存在11个磷酸化位点...     

水蕨抗艾滋病病毒蛋白CVNH及其突变体在毕赤酵母中的表达（英文）

CVN(Cyanovirin-N)是一种高效的抗HIV蛋白。Cyanovirin-N(CVNH)家族是CVN的同源蛋白,具有与CVN的肽链折叠类型并且具有高度保守的抗HIV的结构域。把水蕨Ceratopteris thalictroides野生型和突变型CtCVNH蛋白的编码序列分别克隆到真核表达载体pP ICZαA,结果所有野生型wC tC VNH和突变型mCtCVNH基因分别产生两条带,Western blot确认大小分别为22 000和24 000。采用超滤离心和Ni-NTA亲和色谱法纯化蛋白质,糖基化检测证实wC tC VNH蛋白不存在N-糖基化位点,可能的原因是载体pPICZαA中α因子信号肽序列的不完全切割或存在一些非糖基化的其它翻译后修饰,为今后进一步研究CtCVNH的药代动力学和药效学奠定了坚实的基础。     

人类Batten病基因CLN3及其突变的生物信息学分析

利用生物信息学方法对与儿童蜡样质脂褐质沉积症(NCLs)相关基因CLN3的结构进行了深入的分析.根据CLN3的Mrna序列对其进行了染色体精确定位,确定CLN3的ORF及其外显子的位置;分析CLN3蛋白质(CLN 3P)结构特点和修饰位点,并明确近缘种及远缘种的保守区域和突变致病的关系.结果表明,CLN3位于人类16号染色体的短臂(16(p12.1～p11.2));基因全长为14804bp,包含15个外显子和14个内含子,ORF长度1317bp,编码438个氨基酸.蛋白质功能域分析表明,CLN 3P是一种分子量为43kDa的高度糖基化的溶酶体膜蛋白,该蛋白存在酰基化、糖基化和多种磷酸化修饰位点,在近缘的CLN 3P中存在高度保守的区域,进一步对10个远缘蛋白的多序列进行比对,发现了该蛋白质中最为保守的区域;45种CLN 3P的突变分析显示,主要的突变位于101、161～162、170、187、199、211、295、327、330、334、352等12个氨基酸位点,这些突变几乎发生在保守区域,突变还表现出一定的分布特点及地区差异,说明保守序列的突变是该疾病产生的重要原因,为该病的分子诊断提供了依据.     

昆虫细胞中共表达人糖基转移酶对重组蛋白SEAP表达的影响

杆状病毒-昆虫细胞表达系统有表达量高及蛋白翻译后修饰较完善等特点,但与哺乳动物相比其缺乏几种关键的糖基转移酶.许多研究表明将哺乳动物的糖基转移酶基因转入昆虫细胞中,能使得昆虫细胞表达蛋白的修饰得到有效改善.本研究通过RT-PCR克隆了人Ⅱ型N-乙酰葡萄糖胺转移酶(β-1,2-N-acetylglucosaminyltransferaseⅡ)和Ⅰ型β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-galactosyltransferase)基因,并将它们分别插入重组杆状病毒上,获得了表达GnT2和β4GalT1的重组杆状病毒.以具有糖基化修饰位点的人分泌型碱性磷酸酶(Secreted Alkaline Phosphatase,SEAP)为对象,将表达糖基转移酶的重组杆状病毒和表达SEAP的重组杆状病毒共感染细胞,Western blot分析结果表明共感染时所表达的SEAP蛋白条带分子量明显大于其单独表达时的分子量.结果表明重组病毒共感染对杆状病毒-昆虫细胞表达的SEAP有修饰作用.     

重组毕赤酵母植酸酶N-糖基化位点质谱鉴定

为系统评估重组毕赤酵母植酸酶的N-糖基化充分性,建立了一种通过联用高效液相色谱-串级质谱来分析植酸酶氨基酸序列及N-糖基化位点的技术.分别发酵了3株基因组已整合不同植酸酶基因的毕赤酵母.发酵液上清经离子交换与凝胶过滤后获得纯化的植酸酶.使用PNGase F或Endo H脱糖基化酶处理植酸酶后,用胰蛋白酶消化脱糖基化产物.通过纳升级高效液相色谱分离胰蛋白酶切产生的肽段混合物.并在联用的串级质谱上进行肽段测序与N-糖基化位点鉴定.结果显示3种植酸酶蛋白的可检测序列覆盖率均在69%以上,且与文献报道不同,均存在糖基化位点修饰不充分的现象.本实验结果证明了高效液相色谱-串级质谱联用法检测植酸酶N-糖基化位点的有效性,并为植酸酶的糖基化研究提供了新的基础.     

蛋白质的磷酸化修饰及其研究方法

蛋白质磷酸化是一种重要的翻译后修饰，它参与和调控生物体内的许多生命活动。随着蛋白质组技术的不断发展，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的重视。本文介绍了蛋白质磷酸化修饰的主要类型与功能、磷酸化兰白质及磷酸化肽的标记和分离与富集、磷酸化肽及磷酸化位点分析以及蛋白质的磷酸化改性等方法,并综述了近年来国内外的主要研究进展。     

甘蓝型油菜过氧化物酶的生物信息学分析

目的 分析甘蓝型油菜的过氧化物酶(Peroxiredoxin, PRDX)家族成员的生物学信息，以期为油菜及相近植物中PRDX的酶学特征及植物抗氧化的分子机制研究提供依据.方法 利用生物信息学方法，分析NCBI(National Center for biotechnology information)数据库中注册的7种油菜PRDX蛋白质的理化性质、信号肽、磷酸化位点、糖基化位点、蛋白质二级结构、三级结构及系统进化特点.结果 甘蓝型油菜PRDX蛋白质比较稳定；氨基酸序列中无信号肽，且不是分泌蛋白；该家族蛋白质中存在较多潜在糖基化位点和磷酸化位点；蛋白质二级结构、三级结构预测结果显示其结构具有极大相似性，且主要以α-螺旋和无规则卷曲为主；系统进化树将该家族成员分为了两个亚家族.结论 本研究为进一步探索植物PRDX家族的生物学功能提供了参考依据.     

基因表达系统与转基因动物乳腺反应器

出于研究、医疗或工业目的，常常需要大量置备各种生物活性蛋白质，为此已经建立了多种基因工程表达系统，如微生物发酵系统、真核细胞培养系统、转基因植物表达系统和转基因动物表达系统等。近几年，利用转基因动物作为生物反应器由乳汁中生产蛋白药物的研究取得了很大进展，有多种动物可被用于转基因。基本过程是将基因构件显微注射到单细胞期受精卵，基因构件以一定几率整合到受体基因组中。通常转基因和其表达模式可忠实地遗传。许多蛋白将以高浓度低成本由转基因家畜的奶中生产。这些转基因动物与传统的动物细胞培养和细菌发酵技术相比尤显高效。乳腺能完成包括二硫桥形成、酰胺化、羧基化和糖基化在内的翻译后修饰，１头转基因羊就是１套发酵罐。据预测，到２０１０年由转基因动物生产的蛋白药物占全部基因工程药物的比率将增长到９５％以上。     

一个与油菜黄化相关的未知功能基因克隆及表达

以构建的油菜幼叶黄化突变体Cr3529消减文库中一个未知功能的差异表达基因片段为基础,应用RACE-PCR技术,扩增并克隆到两个cDNA全序列,分别命名为BnCr4和Bn-Cr4-1.测序结果显示,BnCr4编码区序列大小为1395 bp,编码465个氨基酸,而BnCr4-1编码区序列长1311 bp,编码437个氨基酸.BLAST结果表明它们与拟南芥中的一个未知功能基因的cDNA同源性分别为87%和80%.功能预测显示它们含有与蛋白质的修饰作用有关的多个活性位点,如磷酸化、糖基化、酰胺化以及磷酸泛酰巯基乙胺结合位点,可能是一种新的与cAMP介导的蛋白质磷酸化与去磷酸化作用有关的蛋白.Northen杂交结果显示该基因在Cr3529子叶期和幼叶期的表达高于野生型油菜,显示该基因的表达与突变性状紧密相关.最后,原核表达了BnCr4,得到了与预计分子量相同的融合蛋白.     

植物蛋白质N-糖基化修饰研究进展

N-糖基化与植物蛋白质正确折叠、细胞凋亡、器官发育及信号转导等生物学功能密切相关.主要对植物蛋白N-糖基化的结构、生物合成、加工修饰、相关酶生物学功能,以及糖蛋白的分离鉴定方法等进行了综述,并探讨了植物糖基化蛋白功能研究的应用前景及存在的问题.     

NDV核心抗原重组杆状病毒转移载体的构建

F和HN蛋白是新城疫病毒(NDV)中两种具有抗原性的表面糖蛋白．对NDV中国强毒株F48E8的F和HN基因进行了全长核苷酸序列分析．F基因的长度为1662bp，编码553个氨基酸，糖基化位点与已知的其他株系的位点相同；HN基因全长1904bp，编码571个氨基酸，其中第5个糖基化位点(第500～502个氨基酸)由NPT突变成NPV．为了便于在杆状病毒中表达，将F和HN基因的核心抗原区通过PCR扩增，并成功地克隆进杆状病毒转移栽体中，为利用杆状病毒表达系统生产抗新城疫病毒的基因工程疫苗打下基础．     

小分子探针2-叠氮乙酰氨基-1,3,4,6-四乙酰基葡萄糖的合成

实验以氨基葡萄糖盐酸盐为起始原料,经过一系列反应(共5步)得到目标产物6,其可作为非天然小分子探针代谢标记O-GlcNAc糖基化蛋白.在步骤3的丙酮、浓盐酸、50℃条件下分离得到一种具有荧光性能的中间体7,并通过核磁、质谱等检测方法确定其结构,同时探讨了其生成机理.     

基于LightGBM的蛋白质类泛素化修饰位点预测

蛋白质类泛素化修饰位点的准确识别对基础研究和药物开发都具有重要意义.该文提出了一种基于蛋白质序列特征的类泛素化修饰位点预测模型.该模型结合氨基酸的物理化学属性统计特征和氨基酸序列二元语法模式特征,训练一种轻量型梯度提升机(Light gradient boosting machine,LightGBM)分类器预测某个蛋...     

基于双功能荧光标签8-氨基1,3,6-萘三磺酸的N-连接糖基化富集方法

发展了基于双功能荧光标签8-氨基1,3,6-萘三磺酸(ANTS)选择性糖基化蛋白质标记和二氧化钛(TiO2)亲和富集的N-连接糖基化富集新方法.模式蛋白质细胞色素c、肌红蛋白、核糖核酸酶b、抗生素和α-1-抗胰蛋白酶经ANTS标记后,所有糖基化蛋白质均发出亮绿色荧光,而非糖基化蛋白质则不能观测到荧光;进一步采用TiO2对酶切产生的N-连接糖基化肽段进行富集,同时实现了中性糖肽和唾液酸糖肽的选择性富集.通过进一步分析人血清N-连接糖基化蛋白质,共鉴定到39个唯一的N-连接糖蛋白,包括了53个唯一的N-连接糖基化位点;此外,该方法与采用TiO2法直接富集以及肼化学法富集鉴定到的交叠糖基化位点数均小于40%,说明这一新方法与传统方法在糖基化肽段富集方面具有一定的互补性,有望用于复杂蛋白质样品的N-连接糖基化高效富集.     

热加工过程中植物源蛋白的糖基化作用研究进展

近年来,食品加工过程有害物产生机理研究已成为食品安全研究的热点和前沿领域。热加工是豆制品和小麦制品最普遍的加工方式,食品热加工过程中由美拉德反应介导的蛋白质糖基化作用不仅会导致蛋白质结构、营养特性及功能特性发生变化,还会形成一些有害产物。在食品热加工过程中,还原糖是主要的反应性羰基化合物,除此之外,还原糖在热加工过程中会降解形成α-二羰基化合物(α-dicarbonyl compounds,α-DCs),这些化合物是食品热加工过程中发生的美拉德反应的重要中间产物,它们具有更强的反应活性,能够与蛋白质发生糖基化反应,进而改变蛋白质的结构和营养特性。目前,越来越多的学者已针对食品热加工过程中还原糖和α-DCs对蛋白质的糖化修饰作用展开研究,然而,还未见到有文献针对食品热加工过程中植物源蛋白质的糖基化修饰问题进行讨论。介绍了大豆蛋白和麦谷蛋白的结构及营养特性,分析了食品中参与糖基化反应的活性羰基化合物及其产生的机理,并重点介绍了食品热加工过程中植物源蛋白质糖基化的研究进展,希望对食品热加工过程中蛋白质修饰机理和有害物产生机理的进一步研究提供参考。     

突变型hGM—CSF在毕赤甲醇酵母中的分泌表达

临床研究发现，与大肠杆菌体系生产的hGM-CSF相比，利用酵母表达系统生产的hGM-CSF，具有毒副作用小等优点，鉴于非糖基化的hGM-CSF生物活性比人体天然产生的糖基化GM－CSF活性更高，采用PCR定点突变的方法修改hGM-CSF基因中的糖基化位点，进而在毕赤酵母（Pichia pastoris）中实现该突主型基因的高效表达。实验结果表明，突变型基因的表达产物具有天然hGM-CSF的活性。