酵母海藻糖合成酶基因植物表达载体的构建

以从原核表达载体中酶切得到的tps1基因为模板，设计适当的引物，利用PCR技术，克隆出核苷酸数大约1.5k的片段，PCR产物经回收后，与PCAMBIAI303载体连接并转化大肠杆菌DH5a，阳性重组子经PCR鉴定，结果表明已获得海藻糖磷酸合成酶基因的植物表达载体。     

番茄八氢番茄红素合成酶基因的克隆及超量表达载体构建

八氢番茄红素合成酶是植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的关键酶,根据番茄该酶的编码基因序列设计一对引物,通过RT-PCR在番茄中扩增出一个约1500 bp的全长cDNA片段.测序结果表明,此片段包含一个长为1239 bp的完整的编码框,其氨基酸序列与辣椒、向日葵、万寿菊、枸杞、番木瓜、温州蜜柑、拟南芥八氢番茄红素合成酶基因编码的氨基酸序列的一致率分别为88%、75%、75%、74%、73%、73%、7l%.对这个全长片段构建了超量表达载体,酶切检测表明该片段已插入植物表达载体.     

pBK-CMV⊿-EGFP-SNAT2质粒载体构建及其表达鉴定

SNAT2是SLC38基因家族编码的Na＋偶联中性氨基酸转运蛋白中属于systemA的成员之一．它在谷氨酸一谷氨酰胺循环、肝脏糖质新生等生物通路中发挥重要作用．增强型绿色荧光蛋白EGFP的连接对于SNAT2在细胞表达中的定位以及检测都有很大的帮助．采用PCR扩增和酶切技术将EGFP连接到质粒pBK-CMV△-SNAT2中SNAT2的N端．通过酶切后琼脂糖凝胶电泳和测序验证得到pBK-CMV△-EGFP—SNAT2质粒载体,将构建好的质粒瞬时转染进人胚肾细胞（HEK293cells）用Westernblot和激光共聚焦电子显微镜检测EGFP-SNAT2的表达与亚细胞定位．结果表明：EGFP．SNAT2在细胞中正确表达并定位于细胞膜上．pBK．CMV么．EGFP．SNAT2质粒载体的构建对于进一步研究SNAT2的结构和功能具有重要意义．     

pegfp/glur6重组表达载体的构建

目的：构建pegfp/glur6重组表达载体。方法：用基因重组技术构建pegfp/glur6重组表达载体,并通过酶切和PCR鉴定。脂质体法转染HEK293细胞,用荧光显微镜检测。结果：经酶切和PCR鉴定重组质粒pegfp/glur6重组表达载体构建成功。转染HEK293细胞后,荧光显微镜显示融合蛋白在细胞中表达。结论：基因重组技术成功构建pegfp/glur6重组体。     

番茄ACC合成酶基因的反义RNA—核酶嵌合基因植物表达载体的构建及对番茄的转

将克隆的番茄ACC合成酶基因的反义RNA－核酶联合的DNA序列用Hind Ⅲt KpnI切割后重组于植物表达载体pGA643中,用三亲融全导入农杆菌LBA4404中,采用叶盘法转化茄子叶,诱导出再生小植株,获得了卡那霉素的抗性植株。提取植物总DNA,用pGA643作探针,通过斑点杂交,已筛选出整合有外源基因的工程植株。为进一步研究该嵌合基因对ACC合成酶基因表达的影响及获得商品化的转基因番茄奠定了基础。     

矮牵牛ACS2基因正、反义重复表达载体的构建

将矮牵牛ACS2基因的正义重复和反义重复分别与植物表达载体质：pBI-121连接,构建ACS2基因的正义重复和反义重复表达载体,经PCR和酶切鉴定,基因已成功构建到表达载体质粒上,为延长矮牵牛花期的基因工程研究奠定了基础．     

利用pGenesil-1.0构建人Dna2真核表达干扰载体

目的:构建人基因Dna2干扰(RNAi)的真核表达载体.方法:根据GenBank上人Dna2的cDNA序列设计并合成两条单链寡核苷酸,退火以后,插入质粒pGenesil-1.0多克隆位点的BamH I和Hind III之间进行重组,构建重组干扰载体,转化DH5α后测序鉴定出阳性菌株.重组质粒以脂质体法转染HeLa细胞,提取Dna2蛋白以免疫印迹法检验干扰效果.结果:设计的目的干扰序列5’-catagccagtagtattcgatg-3’可明显抑制Dna2在HeLa细胞的表达.结论:利用pGenesil-1.0构建的人Dna2干扰载体适用于该基因功能研究.     

斜纹夜蛾SlSCP-2真核表达载体的构建及对胆固醇的吸收

构建pcDNA5/FRT-SlSCP-2和阳性对照pcDNA5/FRT-GFP真核表达载体,将斜纹夜蛾固醇转运蛋白SlSCP-2和绿色荧光蛋白GFP分别整合进入Flp-In~(TM)CHO细胞基因组中的FRT位点上,利用western blotting方法和荧光倒置显微镜观察鉴定SlSCP-2和GFP蛋白在CHO细胞的表达情况.结果表明,重组质粒瞬时转染CHO细胞24h后,pcDNA5/FRT-SlSCP-2和pcDNA5/FRT-GFP均能正确表达目的蛋白,SlSCP-2能够增加细胞对胆固醇的吸收.同时确定了筛选稳定转染细胞株合适的潮霉素浓度.     

小麦atpC基因植物超量表达载体的构建

线粒体ATP合成酶是氧化磷酸化过程中ATP合成起关键作用的多亚基复合体,但近来发现它们在植物应对非生物胁迫反应中起着十分重要的作用。因此,对ATP合成酶的各亚基基因功能的研究有助于阐释其在植物逆境条件下的调节机制,并为研究植物抗逆和防卫反应提供新的途径。线粒体ATP合成酶是能量代谢的关键酶,参与氧化磷酸化反应。atpC基因所编码的线粒体ATP合成酶γ亚基是线粒体ATP合成酶的功能亚基。为了进一步研究它在胁迫反应中的功能,以小麦cDNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出atpC基因。将该基因的cDNA编码序列连接到pCAMBIA1301中,成功构建了小麦pCAMBIA-atpC植物超量表达载体,为后续的转基因研究奠定了基础。     

脑心肌炎病毒pCMV-HA-VP2表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:构建脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis Virus,EMCV)衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2,并在HEK293细胞中表达.方法:提取EMCV的总RNA,RT-PCR扩增VP2基因,酶切后构建带HA标签的真核表达质粒pCMV-HA-VP2,运用脂质体介导法将其转染至HEK293细胞中,分别进行过表达检测、Westernblotting分析及IFA检测来验证VP2基因的转录及表达情况.结果:重组表达载体pCMV-HA-VP2构建成功,转染至HEK293细胞中,VP2蛋白和HA标签融合表达成功.结论:EMCV衣壳蛋白VP2基因的真核表达载体pCMV-HA-VP2在HEK293细胞中的成功表达,为EMCV衣壳蛋白的功能研究提供理想的实验材料,同时也为EMCV感染机制及其受体研究奠定基础.     

LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

为构建人LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达及定位,通过基因重组的方法构建LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体,并通过酶切和基因测序鉴定。脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位。经酶切和基因测序鉴定LMP3／pEGFP-N3重组真核表达载体构建成功。转染HEK293细胞后,荧光显微镜检测显示融合蛋白仅在细胞浆中表达。说明基因重组技术可成功构建LMP3／pEGFP-N3重组体真核表达载体,重组表达的融合蛋白仅存在于细胞浆内。     

双酚类化合物对人胚肾细胞HEK293的毒性和氧化应激的研究

双酚类化合物(bisphenols, BPs)是一类新型环境有机污染物,BPs排放到环境介质后经多种途径进入生物体并在体内蓄积,已逐渐成为威胁环境和健康的重要风险因子。为探明BPs对人体健康的潜在毒性效应,本研究选取人胚肾细胞HEK293作为模型,通过测定细胞活力、胞内活性氧含量、氧化应激参数(SOD、GSH、MDA)及细胞内钙离子水平,比较了BPA、BPS、BPF和BPAF对HEK293细胞的毒性影响。结果表明,BPA、BPS、BPF和BPAF能够不同程度的抑制HEK293细胞活力,通过促进氧化应激产生 ROS,降低抗氧化能力,迅速提高细胞内Ca²⁺水平,诱导HEK293细胞损伤。在本研究所选的浓度范围内,BPAF对HEK293细胞的毒性影响最大,BPA和BPF对HEK293细胞的毒性影响次之,BPS对HEK293细胞的毒性影响较小。本研究为深化了解双酚类化合物的毒理学系统研究和风险评估提供参考依据。     

人纤溶酶原Kringle 1基因的克隆与表达

从人肝组织中抽提总RNA，通过RT-PCR方法扩增出人纤溶酶原（plasminogen)Kringle 1片段，构建pPIC9K-K1载体，电击转化酵母，成功获得pPIC9K-K1/GS115工程菌，摇瓶发酵初步结果表明，工程菌能稳定表达可溶性的重组K1蛋白，分子量为15kd，发酵液中的蛋白含量为84.17mg/L。     

人Endostatin基因的克隆及其在Hela细胞中的表达

利用RT-PCR克隆人Endostatin基因,分别构建到双顺反子表达载体pIRES2-EGFP和融合表达载体pEGFP-C1中.两个重组表达载体利用脂质体介导转染真核细胞Hela,48 h后可在荧光显微镜下观察到被转染细胞发出绿色荧光.传代10次后,绿色荧光仍持续表达,说明是稳定转染.以转染细胞的总DNA为模板PCR检测Endostatin基因已整合到细胞染色体上.利用兔抗人Endostatin抗体对已转染细胞进行免疫组化检测,显微镜下观察,转染的细胞显棕红色,表明Endostatin在转染细胞内稳定表达.本试验通过报告基因检测,DNA检测,免疫细胞化学检测三个水平证明Endostatin已整合到细胞的染色体上,为基因治疗以及联合治疗打下基础.     

不同基因型的人类乙醛脱氢酶2基因的克隆及表达

乙醛脱氢酶2是细胞防御系统的重要组成部分,它催化各种对人体有害的醛类成相应的酸．实验证明,东亚人群中存在大量的突变基因型aldh2*2,且aldh2*2基因型与酒后宿醉程度(脸红及不适感)相关．本实验采用昆虫细胞表达系统sf9高效表达ALDH2和ALDH2*2,并分别检测两种蛋白对底物乙醛的催化活性,发现二者对乙醛的催化活性差异显著,其中ALDH2的Km为1．70μmol／L,而ALDH2*2的Km为61．56μmol／L,支持了前人关于ALDH2的遗传缺陷可能导致醉酒及酒后不适感的结论．     

pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞系中的表达

目的:构建pEGFP-C1-MCH真核表达载体,并将其转染入HEK293细胞中,筛选阳性细胞克隆,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及机制提供细胞模型.方法:提取脑组织总RNA,反转录为cDNA,参照Genbank中提供的序列设计引物扩增MCH基因全长.再将该基因全长cDNA克隆至质粒pEGFP-C1,经菌落PCR筛选及双酶切和DNA测序鉴定,成功构建了含有目的基因MCH的重组质粒pEGFP-C1-MCH.并利用脂质体2000介导其转染HEK293细胞,用荧光显微镜和RT-PCR检测EGFP和MCH在细胞中的表达.结果:克隆的pEGFP-C1-MCH质粒序列中的MCH与Gen Bank相符;细胞转染72 h后,转染成功的细胞在荧光显微镜下表达较强的绿色荧光,MCH基因稳定表达.结论:pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的稳定表达,为研究MCH基因在能量代谢中的功能及作用机制提供了实验模型.     

人RP2基因在果蝇胚胎细胞中的表达

将质粒pJLA503中的RP2编码cDNA用PCR的方法扩增,并与pIND-3myc质粒上的人c-myc编码序列连接到果蝇转基因载体pUAST上,构建了UAS－RP2－3myc和UAS－RP2(del6)-3myc融合质粒。用脂质体转染的方法,将质粒导入果蝇培养细胞系Schneider line2(S2),并用PCR加以证实,然后通过Western blot检测证明了RP2和RP2 del6的表达。证明了人的RP2基因在果蝇细胞中表达的可能性,说明果蝇系统是可以用来分析人的RP2基因功能的。     

磷酸钙法将MMP-2，MMP-3双基因干扰载体转入HEK293T细胞的效率观察

检测用磷酸钙法能否将修饰后用于沉默MMP-2,MMP-3基因的慢病毒载体有效地转入到HEK293T细胞。利用磷酸钙法,MMP-2,MMP-3双基因干扰载体（MMP组）与对照质粒（对照组）被分别转染HEK293T细胞,在转染后的第24,48及72h,通过计算绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞数的百分比来判断转染效率。转染24h后,两组细胞均生长状况良好,荧光显微镜下观察,已有大量绿色荧光出现,计算MMP组转染效率为（91．5±6．2）％,对照组转染效率为（80．3±4．7）％;转染后48—72h,两组感染效率均未见明显下降。与对照相比,插入了MMP-2,MMP-3 shRNA模板序列的慢病毒载体没有降低磷酸钙法转染HEK293T细胞效率,反而有所增高。     

人肿瘤坏死因子可溶性受体I cDNA的克隆及其在原核和真核细胞中的表达

以人的胎盘总ＲＮＡ为模板,用ＲＴ－ＰＣＲ的方法,获得人肿瘤坏死因子可溶性受体Ｉ（ｓｈＴＮＦＲ－Ｉ）的ｃＤＮＡ,并对其进行全序列分析,在此基础上构建了原核及真核的表达载体,进行真核瞬间表达及活性测定和原核表达及产物初步纯化