新型抗菌肽基因设计、合成及在酵母中的表达(Ⅱ)——抗菌肽 AD 基因在酵母中的表达

将抗菌肽ＡＤ基因定向克隆到大肠杆菌－酵母穿梭质粒ｐＣＬＷＡ２的ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ位点上,构建成含抗菌肽ＡＤ基因的重组质粒ｐＣＡＤ,转化酵母宿主菌ＡＢ１０３,转化子在缺乏亮氨酸的ＳＤ选择培养中３０℃培养４８ｈ,培养液经简单纯化后,活性蛋白ＰＡＧＥ和琼脂孔穴扩散法测定抑菌活性表明,抗菌肽ＡＤ基因在酵母中获得表达．     

新型抗菌肽基因设计,合成及其在酵母中的表达（Ⅰ）：杂合抗菌肽基 …

以化学合成并证实抗菌活性和抗菌谱都高于天然抗菌肽的杂合肽ＣｅｃｒｏｐｉｎＡ１－１１Ｄ１２－３７的氨基酸序列为基础，选用酵母高频使用密码设计了一种新型抗菌肽基因。     

抗菌肽AD基因的改造及在毕赤酵母中的表达

采用PCR技术改造抗菌肽AD基因，将其C末端改造为Asn编码，改造后的抗菌肽Cecropin AD基因克隆到pPICZα－A载体上，构建成酵母重组分泌型表达载体，转化毕赤酵母（Pichia pastoris)受体菌GS115中，采用zerocin抗性标记筛选重组转化子，经摇瓶发酵，浓缩发酵液进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和抑菌活性检测。结果表明，改造后的Cecropin AD基因在毕赤酵母中获得了表达，表达产物经α－Factor信号肽引导分泌到胞外，具有较强的杀菌活性。     

新型抗菌肽基因设计、合成及其在酵母中的表达(Ⅰ)——杂合抗菌肽基因的设计与合成

以化学合成并证实抗菌活性和抗菌谱都高于天然抗菌肽的杂合肽ＣｅｃｒｏｐｉｎＡ１－１１Ｄ１２－３７的氨基酸序列为基础,选用酵母高频使用密码子设计了一种新型抗菌肽基因,基因合成采用二次ＰＣＲ（聚合酶链式扩增）方法．设计和合成的基因全长１４０个碱基对,包括氨基酸编码序列、起始密码子、终止密码子和两端限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ识别顺序,合成的基因克隆于ＰＣＲＴＭ２．１载体上．经ＤＮＡ序列分析证实,合成基因碱基序列与设计序列完全一致．     

两种杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及活性测定

参照毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)的偏好密码子,改造克隆杂合抗菌肽CA(1～7)M(4～11)和CB(1～7)M(4～11)基因,将改造后的基因克隆到pPICZα-A 载体中,构建分泌型表达载体pPICZα-A-CAM和pPICZα-A-CBM,转化宿主菌Pichia pastoris X-33,在甲醇的诱导下进行表达.实验结果表明,杂合抗菌肽获得表达,两种表达产物具有明显的抗菌活性.此外,本文还比较了二者的抗菌谱,分析了杂合肽的性质,优化了酵母电转化条件.     

ApiIa抗菌肽基因的化学合成,克隆及其在酵母中的表达

用固相亚磷酰胺法合成了ＡｐｉＩａ抗菌肽基因,全长为８０个核苷酸。它被分成４个寡核苷酸片段,分别在ＤＮＡ合成仪上的合成经分离纯化后的寡核苷酸片段经酶促连接,然后被克隆到分泌型载体质粒ｐＡＦＤ１０１上,经限制酶酶切,ＰＣＲ模板检测以及双链ＤＮＡ序列分析检测,证明合成的ａｐｉＩａ基因和设计的完全一致。     

黑鲷抗菌肽hepcidin在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性

鱼类抗菌肽hepcidin具有广谱抗菌活性.利用PCR技术扩增获得了黑鲷抗菌肽hepcidin (AS-hepc2)的前体肽和成熟肽 cDNA 序列,片段大小约250 bp.将其与毕赤酵母(Pichia pastoris) pPIC9K 质粒连接,构建了分泌表达载体pPIC9K/AS-hepc2 .电击法转化重组表达载体,经过G418筛选和选择性培养基以及PCR鉴定,得到的克隆子都为Mut+.以甲醇诱导pPIC9K/AS-hepc2,分泌表达上清中获得10 ku左右的表达产物,与预期的目的蛋白黑鲷hepcidin的前体肽和成熟肽的大小相符.表达试验证明,随时间的延长,表达产物量增多,至120 h 达到高峰.表达产物具有很强的热稳定性.用抑菌圈法测定重组蛋白Pro-AS-hepc2 的抗菌活性,发现能抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长.     

小鼠LEAP-2成熟肽基因在毕赤酵母中的分泌表达

实验利用已构建的分泌型重组表达质粒pPIC9-mmLEAP-2,氯化锂转化表达宿主菌GS115毕赤酵母;应用表型和PCR技术筛选高拷贝转化株。经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS—PAGE分析重组mmLEAP-2表达量,为进一步研究mmLEAP-2的活性奠定了基础。     

抗菌肽SMAP-29在毕赤酵母中的表达

依据毕赤酵母密码子偏好性,设计合成抗菌肽SMAP-29成熟肽基因片段,克隆到表达载体pPIC3.5K上,SalI线性化后转化毕赤酵母GS115,418抗性筛选高拷贝克隆,再由酵母菌落PCR鉴定;阳性克隆用甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE分析,结果在诱导第2d的酵母裂解液中检测到与预期的SMAP-29分子量接近,约3.2kD的诱导表达带;Trizol法提取酵母总RNA,并通过RT-PCR扩增SMAP-29mRNA,发现表达期的酵母细胞中存在SMAP-29mRNA,而对照没有检出,表明SMAP-29在毕赤酵母中存在表达。     

Monellin基因在酵母中的表达研究

本实验根据毕赤酵母偏爱密码子,人工合成了高甜度monellin基因,并构建了重组分泌型酵母表达载体pPIC9KM,通过电击转化获得了可高效分泌表达有甜味活性高甜度monellin的重组毕赤酵母GS115/pPIC9M.通过PCR检测证实monellin基因已经整合进酵母基因组,SDS-PAGE和Westerm blot免疫杂交知所表达的蛋白是目的蛋白,最后通过双盲测定证实表达的蛋白比同等重量的蔗糖甜约1000倍.     

抗菌肽A—蜂毒素杂合肽基因在大肠杆菌中的克？…

采用Ｅｃｏ ＲⅠ和ＢａｍＨ Ⅰ接头将化学合成的大小为５对碱基的ＣＡ（１－７）Ｍ（５－１２）杂合肽基因克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ分泌表达载体ｐＩＮ－Ⅲ．ＯｍｐＡ２上的ＥｃｏＲⅠＢａｍＨⅠ位点之间，并对其在Ｌｐｐ启动子和Ｌａｃ启动子／操纵调控下的分泌表达进行初步研究。     

Hepc 20在毕赤酵母中的胞内表达及鉴定

构建了Hepc 20的毕赤酵母表达载体,在毕赤酵母中能成功表达有活性的Hepc 20。优化了菌株的培养诱导条件,结果表明BMMY培养基是Hepc 20表达和重组菌株生长的最佳培养基,甲醇诱导终体积分数0.5%,在此条件下Hepc 20在重组菌株中的表达量约为3.6 mg/L。Western blot检测显示的22000处的条带为重组Hepc 20条带;ELISA验证表明重组Hepc 20可以跟抗体特异结合,琼脂扩散法抗菌实验表明重组Hepc 20对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌表现出抗菌活性。     

酵母Elp3在毕赤酵母中的分泌表达及活性测定

酵母Elp3是Elongator复合物的催化亚基,可参与组蛋白乙酰化修饰与基因转录延伸.生物信息学分析及有关研究表明Elp3除组蛋白乙酰转移酶(Histone acetyltranferase,HAT)活性外,可能还拥有组蛋白去甲基化酶活性.本文以yElp3的pYES2yElp3质粒为模板,PCR获得yElp3基因全长,插入改造过的毕赤酵母表达载体pPIC9KH,转化巴斯德毕赤酵母GS115菌株.经表型鉴定、PCR分析及G418筛选获Mut+型多拷贝整合菌,经0.5%的甲醇诱导和Ni-NTA纯化,得到目的蛋白并对其进行体外酶活测定.SDS-PAGE分析表明yElp3在毕赤酵母中实现了高效分泌表达,Western印迹证实得到的蛋白为yElp3.OPA法测得纯化蛋白拥有较好的HAT活性,具有生物活性的Elp3蛋白的获得为体外测定其第二结构域是否有催化活性奠定了基础.     

肝癌差异表达基因HCUTAL2在酵母Pichia pastoris中的表达

利用正常肝组织和肝癌组织的mRNA,通过逆转录方法,将Cy3和Cy5二种荧光分别标记到2种组织的cDNA上,制备成cDNA探针,并与包含4096条各种人类基因的DNA表达谱芯片进行杂交及扫描,重复11次实验,通过计算机数据处理判定基因是否在上述2种组织中存在表达差异,从而鉴定参与肿瘤发生的基因,其中1类差异表达基因为CUTA的高度同源基因,该基因可能参与重金属离子在体的代谢,对该基因拟编码的蛋白质进行酵母表达。     

酵母表达系统表达外源基因的研究进展

阐述了几种常用的酵母表达系统的研究现状及应用前景,并对酵母分泌的外源蛋白的含量及糖基化程度进行了比较．我们认为：甲醇营养型酵母分泌的外源蛋白量高且无过度糖基化现象,具有良好的应用前景     

人白血病抑制因子基因在酵母中的融合表达

用PCR突变的方法使人白血病抑制因子基因的终止密码子缺失,并与质粒pPICZαA上的myc表位及6个组氨酸处于同一读码框,构建融合表达载体pPICZαA-hLIF^M。通过氯化锂化学转化法使表达载体整合到毕赤巴斯德酵母X－33的基因组DNA中,转化子经甘油增菌和甲醇诱导,实现了hLIF基因在毕赤酵母表达载体系统中的表达。SDS－PAGE检测和Western blot分析结果表明在相对分子质量为61000处有一条人白血病抑制因子特异蛋白带。凝胶薄层扫描分析结果显示表达的目的蛋白占培养液上清总蛋白的33．3％。且该表达产物具有抑制小鼠畸胎瘤细胞F9克隆形成的活性。     

Reteplase基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

进行了组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体Reteplase(r-PA)基因的克隆,并在甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)中实现了胞外表达。以基因工程菌株里氏木霉(Trichoderma reesei)306染色体DNA为模板,通过PCR技术克隆了r-PA基因,将扩增产物克隆到pMD18-T载体上并进行了序列测定。测序结果表明:克隆到的基因序列长1.1 kb,与已发表的Reteplase基因同源性达99.91%,其编码的氨基酸顺序一致。文中还构建了甲醇毕赤酵母分泌性表达载体pMETαA-r-PA,用PacⅠ单酶切将pMETαA-r-PA线性化后,采用电转化的方法将其导入甲醇毕赤酵母PMAD16中,PCR和表型鉴定表明,筛选到Reteplase基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上的阳性克隆。经摇瓶初步培养及以甲醇为唯一碳源诱导表达,胞外Reteplase表达水平最高达27.93mol/(s.L)。     

山蛭素（haemadin）在毕赤甲醇酵母中的表达及其性质鉴定

人工合成山蛭素基因后,利用基因重组的方法将山蛭素的基因克隆到pPicZαA载体,经过线性化,电转至毕赤酵母GS115中表达。使用浓度高达1500 μg/mL的zeocin筛选得到高拷贝插入的GS115-H菌株,经过优化摇瓶表达条件表达量达到100 mg/L。摇瓶培养物经离心取上清,分别使用3 kD和10 kD的超滤膜超滤,阳离子交换层析和凝胶过滤层析等纯化步骤之后,得到纯度高于95%的目的蛋白,产出量为40 mg/L,回收率为40%。通过以chromozym TH为底物的凝血酶酰胺水解实验证实了其体外生物学活性：其抑制凝血酶常数为(2.46±0.13)×10^-13 mol/L。     

锯缘青蟹抗菌肽Scygonadin基因的转录表达特性研究

Scygonadin是从锯缘青蟹生殖系统分离获得的一种抗菌肽,我们用Dot-blot检测了该基因在锯缘青蟹幼体(溞状幼体和大眼幼体)和成体锯缘青蟹(雄性和雌性)的鳃、甲壳、眼、血细胞、肝胰脏、心脏、肌肉、甲壳下皮层、胃和生殖系统等10个不同组织器官中的转录表达情况.结果显示,该基因仅在雄性生殖系统中转录表达.进一步分析该基因在性成熟雄性锯缘青蟹和远洋梭子蟹生殖系统中不同部位(精巢、输精管、贮精囊和射精管)的转录表达情况,结果显示,Scygonadin基因主要在性成熟锯缘青蟹的射精管中转录表达.     

葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中的高效分泌表达

为了获得高效分泌表达葡萄糖氧化酶(GOD)的毕赤酵母,采用黑曲霉来源的GOD基因序列,按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化,构建AOX1启动子诱导的分泌表达载体pPIC9K-GOD和重组菌G/GOD,通过提高遗传霉素G418浓度筛选到第1代高拷贝高产量重组菌G/GODM,单位细胞干重胞外产酶水平可达5843.2 U/g,...