新型抗菌肽基因设计、合成及在酵母中的表达(Ⅱ)——抗菌肽 AD 基因在酵母中的表达

将抗菌肽ＡＤ基因定向克隆到大肠杆菌－酵母穿梭质粒ｐＣＬＷＡ２的ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ位点上,构建成含抗菌肽ＡＤ基因的重组质粒ｐＣＡＤ,转化酵母宿主菌ＡＢ１０３,转化子在缺乏亮氨酸的ＳＤ选择培养中３０℃培养４８ｈ,培养液经简单纯化后,活性蛋白ＰＡＧＥ和琼脂孔穴扩散法测定抑菌活性表明,抗菌肽ＡＤ基因在酵母中获得表达．     

新型抗菌肽基因设计,合成及其在酵母中的表达（Ⅰ）：杂合抗菌肽基 …

以化学合成并证实抗菌活性和抗菌谱都高于天然抗菌肽的杂合肽ＣｅｃｒｏｐｉｎＡ１－１１Ｄ１２－３７的氨基酸序列为基础，选用酵母高频使用密码设计了一种新型抗菌肽基因。     

新型抗菌肽基因设计、合成及其在酵母中的表达(Ⅰ)——杂合抗菌肽基因的设计与合成

以化学合成并证实抗菌活性和抗菌谱都高于天然抗菌肽的杂合肽ＣｅｃｒｏｐｉｎＡ１－１１Ｄ１２－３７的氨基酸序列为基础,选用酵母高频使用密码子设计了一种新型抗菌肽基因,基因合成采用二次ＰＣＲ（聚合酶链式扩增）方法．设计和合成的基因全长１４０个碱基对,包括氨基酸编码序列、起始密码子、终止密码子和两端限制性内切酶ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ识别顺序,合成的基因克隆于ＰＣＲＴＭ２．１载体上．经ＤＮＡ序列分析证实,合成基因碱基序列与设计序列完全一致．     

在杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA—28融合基因在酵母中的表达？…

采用酵母杂合启动子ＰＡＤＨＺ－ＣＵＰ１或ＰＡＤＨＺ－ＧＡＰＤＨ及终止子ＴＡＤＨ１,构建了一系列酵母表达载体。在这些表达载体中插入乙肝有面抗原Ｓ－ｐｒｅＳ１融合基因ＳＡ－２８后将含乙肝病毒表面抗原的表达单元克隆至高稳定质粒ＰＨＣ１１的ＢａｍＨⅠ位点。     

ApiIa抗菌肽基因的化学合成,克隆及其在酵母中的表达

用固相亚磷酰胺法合成了ＡｐｉＩａ抗菌肽基因,全长为８０个核苷酸。它被分成４个寡核苷酸片段,分别在ＤＮＡ合成仪上的合成经分离纯化后的寡核苷酸片段经酶促连接,然后被克隆到分泌型载体质粒ｐＡＦＤ１０１上,经限制酶酶切,ＰＣＲ模板检测以及双链ＤＮＡ序列分析检测,证明合成的ａｐｉＩａ基因和设计的完全一致。     

将GNA基因导入莴苣（L.sativa）及其表达的研究

将含ＣａＭＶ３５Ｓ启动子的雪花莲凝集素基因置换Ｔｉ质粒载体ｐＢＩ１２１中的ＧＵＳ基因得到了ｐＢＩＧＮＡ质粒,将其导入农杆菌ＬＢＡ４４０４,得到ＬＢＡ４４０４菌株。     

中国家蚕抗菌肽CMIV基因的合成与克隆

根据从中国家蚕蛹中提取的抗菌肽ＣＭＩＶ的氨基酸序列，设计兼顾大肠杆菌和昆虫两种不同体系偏爱密码子的ＣＭＩＶ基因序列；用固相合成法合成寡聚苷酸，通过二步电泳地快速纯化之，复性，连接并克隆到ｐＵＣ９中，转化大肠杆菌ＪＭ１０９；在Ｘ－Ｇａｌ、ＩＴＰＴＧ，ＡｍｐＬＢ平板上挑选白色克隆，用限制性酶谱法筛选含有合适插入片断的质粒ＤＮＡ。     

含多种抗真菌病基因植物表达载体的构建

含有大麦核糖体失活蛋白（ＢＲＩＰ） 编码序列的质粒ｐＲＣ２４／ＢＲＩＰ改造后, 依次与含有水稻碱性几丁质酶基因ＲＣＨ１０ 和水稻酸性几丁质酶基因ＲＡＣ２２ 编码序列的质粒ｐＡＢＣ２ 以及含有苜蓿β１ , ３葡聚糖酶编码序列的质粒ｐＡＡＧ８９ 连接, 得到了中间载体ｐＲＡＳ１０ ．ｐＲＡＳ１０再与根癌农杆菌双元载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ 连接, 得到了适合水稻转化的双元载体ｐＲＡＳ１３００ ． 利用冻融法将此表达载体导入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４ 中, 并准备将ｐＲＡＳ１３００ 转入水稻, 以期获得对真菌病有广泛且较强抗性的水稻品种     

在大肠杆菌中利用反义RNA抑制乙肝病毒（HBV）X基因的表达

将乙肝病毒（ＨＢＶ）ａｙｗ株完整的Ｘ基因正向重组到原核表达质粒ｐＢＶ－２２１的ＰＬ启动子下游，得到能表达Ｘ蛋白的重组质粒ｐＢＶ－ＨＢＶ（＋）；同时将Ｘ基因反向重组到原核表达质粒ｐＢＶ－２２０的ＰＬ启动子下游，得到能转录Ｘ基因反义ＲＮＡ的重组质粒ｐＢＶ－ＨＢＸ（－）。利用这两个质粒，构建出能同时转录Ｘ基因ｍＲＮＡ和反义ＲＮＡ的重组质粒ｐＥＸ。ＡＮ－ＨＢＸ，并在原核水平上，证实了反义ＲＮＡ对Ｘ基因的表     

斜纹夜蛾NPV多角体基因的克隆和部分测序

本文对ＳＩＮＰＶ基因组作了酶解分析，测得其基因组大小为１４５ｋｂ，并用双酶法确定了ＳＩＮＰＶ基因组的ＨｉｎｄⅢ和ＰｓｔⅠ物理图谱。以含ＡｃＮＰＶ多角体基因的质粒ｐＡＣ－Ⅰ的ＳａｌＩ－Ｃ片段为探针，对ＳＩＮＰＶＤＮＡ酶切片段ｓｏｕｔｈｅｒｎ转印杂交结果，初步判断多角体基因定位于ＰｓｔＩ－Ｂ／Ｃ／Ｄ片段、ＢｇｌⅡ－Ｃ／Ｄ片段、ＢａｍＨＩ－Ｂ／Ｃ片段和ＥｃｏＲＩ－Ａ／Ｂ片段上，且ＳＩＮＰＶ与ＡｃＮＰＶ多角体蛋白基因有６４％的同源性，而以大肠仟菌质粒ｐＵＣ１９为载体对ＳＩＮＰＶ的多角体基因试克隆，得到带有ＢｇｌⅡ－ＰｓｔⅠ双酶切片段的２个克隆子。对这两个杂交阳性克隆子之一的核苷酸序列测定，表明插入片段与ＢｍＮＰＶ多角体基因上游序列亦有一定同源性。     

克隆蓝藻Calothrix sp.PCC7601 cpcB2A2基因的初步研究

从蓝藻Ｃａｌｏｔｈｒｉｘｓｐ．ＰＣＣ７６０１染色体ＤＮＡ中分离出含藻蓝蛋白基因ｃｐｃＢ２Ａ２的略３．８ＫｂＤＮＡ片段，与质粒ｐＵＣ１８重组，构建成一种重组质粒，ｐＰＣ２１８－ＰＣＺ，转化Ｅ．ｃｏｄｉＪＭ１０９，获得了一系列克隆子，经斑点分子杂交和限制性内切核酸酶分析，筛选出了初步认为含有ｃｐｃＢ２Ａ２基因的克隆子。     

用PCR法构建乳腺特异性表达非乳蛋白基因的研究

将ＰＣＲ法分别从绵羊和人血基因组ＤＮＡ中扩增出的绵羊β－乳球蛋白基因（ＢＬＧ）５＇端调控区８９８ｂｐ的片段和人骨髓单核细胞表面分化抗原ＣＤ１４基因（ｈＣＤ１４）成熟肽１２４５ｂｐ的片段连接。连接片段插入ｐＵＣ１９ ＥｃｏＲＩ－ＫｐｎＩ位点，构建成ｐＢＬＧ－ｈＣＤ１４质粒。该质粒经ＫｐｎＩ及ＣｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ酶切、ＰＣＲ法扩增ＢＬＧ和ｈＣＤ１４分析后，进一步用＾３２Ｐ－ＢＬＧ探针杂交确证。用Ｅｃ     

人源CPP32基因表达对酵母细胞生长的影响

为研究人源ＣＰＰ３２基因的表达对酵母细胞生长的影响,了解其所编码的蛋白质在分子进行过程中的功能特性,将不原ＣＰＰ３２基因克隆到表达载体ｐＧＢＴ９中,得到重组质粒并命名为ｐＧＢＴ９／ＣＰＰ,再将其和对照质粒ｐ（ＧＢＴ９）分别转化到ＣＧ１９４５和ＨＦ７ｃ酵母细胞中,一定时间测定培养物的ＯＤ６００值并做出生长曲线。结果表明：诱导真核细胞程序性死亡的人源ＣＰＰ３２基因对不同种的酵母细胞的作用不同;转化到宿     

小白菜苏云金牙孢杆菌CryIB基因的遗传转化

用限制ＳｐｈＩ和ＥｃｏＲＩ消化质粒ｐＢＹＴＥＳｐ１０１－１和ｐＢＱＸ,将ｐＢＱＸ上的经发行过的苏云金芽直菌杀虫晶体蛋白基因ＣｒｙＩＢ取代ｐＢＹＴＥＳｐ１０１－１上的ＧＵＳ基因,得到一个中间克隆ｐＢＩＷＩＱ－１。用限制酶ＨｉｎｄⅢ消化质粒ｐＢＩＷＩＱ－１,回收含ＣｒｙＩＢ基因的５．１ｋｂＤＮＡ乍段,插入质粒ｐＢＩＮ１９的Ｈｉｎｄ０２８３位点,构建成具卡那霉素抗性的植物表达载体ｐＢＩＷＩＱ－５．ＥＴ     

研究聚ADP核糖基化作用与细胞恶变关系的双基因真核表达重…

本文将聚ＡＤＰ核糖聚合酶基因１．４ｋｂ部分序列反向插入真核表达载体ｐＭＡＭｎｅｏ和ｐＳＭＧ中，同时１２位密码子突变的活化ｒａｓ癌基因也一同克隆到上述载体中，从而获得具有不同真核基因筛选标记的双基因真核表达重组ｐＭＡＭｎｅｏ－Ｃｌ．４－Ｔ２４，ｐＭＡＭｎｅｏ－Ｃｌ．４－ａｒＴ２４，及ｐＳＭＧ－Ｃｌ．４－Ｔ２４，上述质粒的构建成功为研究聚ＡＤＰ核糖基化作用与细胞恶变的关系提供了一种新的分子模型。     

耐热碱性磷酸酯酶基因的亚克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据耐热碱磷酸酯酶基因的酶切图谱和ＤＮＡ序列,分别在基因的起始密友子和终止密码子设计２个突变引物。引物的５‘端分别带有ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ酶切全点。通过ＰＣＲ从质粒ｐＴＡＰ１１８Ｂ中扩增获得了ＦＤ－ＴＡＰ基因的全序列。经过酶切将基因亚克隆于高达载体ｐＪＬＡ５０３。     

乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的组成型表达

以酵母载体ＹＦＤ５９为基础,将乙肝病毒表面抗原ＳＡ－２８融合基因正向插入组成型启动子ＰＰＧＫ１及终止子ＴＰＧＫ１间,得到表达载体ＹＦＤ５９－ＬＳＳ１。并将该表达载体分别转化ＢＪ２１６８,ＤＢＹ７４６,ＪＲＹ１８８,ＢＪ３５０５ ４株不同的酿酒酵母株。再将ＹＦＤ５９－ＬＳＳＩ质粒上的表达单元克隆至高稳定载体ｐＨＣ１１的ＢａｍＨⅠ位点,构建成３个带有不同拷贝数和不同插入方向表达单元的表达载体;ｐＨＣ１     

小麦叶绿体psbA基因的克隆及表达

用ＰＣＲ直接从小麦叶绿体基因组扩增到完整的ｐｓｂＡ基因，并构建了ｐｓｂＡ基因的克隆ｐＴＤ１Ⅱ。为研究ｐｓｂＡ基因在Ｅ·ｃｏｌｉ中的表达，将完整的ｐｓｂＡ基因正向插入高表达载体ｐＫＫ２２３－３中构建表达克隆ｐＫＴＤ１。含有重组表达质粒的转化细胞经ＩＰＴＧ诱导后提取总蛋白，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，小麦叶绿体ｐｓｂＡ基因能在Ｅ·ｃｏｌｉ中表达３２ｋＤ的Ｄ１蛋白，表达的Ｄ１蛋白占细菌总蛋白的３％以上。     

恶臭假单胞菌萘质粒ⅠNL基因的克隆及酶切图谱

恶臭假单胞菌（ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａＧ７）携带的质粒ＮＡＨ７，经限制性内切酶ＥｃｏＲＩ切割后，产生含有萘降解酶全部基因（２４，６ｋｂ）的片段，此片段插入到载体ｐＵＣ１１９的多克隆位点，构成了ｐＫＡＯ质粒，此质粒经ＨｐａＩ，ＥｃｏＲＩ酶切获得的５．１ｋｂ片段亚屯隆到ｐＵＣ１１９中，衍生出ｐＮＮ１质粒，绘制出内切酶图谱。从ｐＮＮＩ质粒上切下含目的基因ｎａｈＩ、ｎａｈＮ和ｎａｈＬ的ｋｐｎＩ－ｋｐｎＩ片段（２．３ｋｂ）．正向插入载体ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ＋中获得重组质粒ｐＮＮ２，反向插入为ｐＮＮ３，将其转化到大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ中，目的基因得以大量增殖。     

乙型肝炎表面抗原基因DNA介导的体液免疫初步研究

用ＣＰＲ技术从纯化的乙型肝炎病毒核酸中扩增出ｐｅｒＳ２－Ｓ基因,并将其定向克隆于真核表达质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）中,构建成带有完整的乙肝表面前Ｓ２抗原基因和Ｓ基因的重组质粒。重组质粒经酶切及部分序列分析鉴定后,瞬时转梁小鼠Ｌ细胞,ＥＬＩＳＡ法检测到培养上清液有ＨＢｓＡｇ表达。用纯化的重组质粒静脉、肌肉和皮下注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,首次接种质粒ＤＮＡ３周后,血清抗体开始出现,再次加强２周后,阳性