线粒体外膜通道蛋白VDAC与靶向肿瘤细胞凋亡

VDAC(Voltage-dependent anion channel)是位于线粒体外膜上的一种主要通道蛋白,参与线粒体内外物质和能量的运输,在线粒体与细胞其它部位的通讯中起重要调节作用.近年来研究发现,VDAC也是线粒体与其它蛋白质相互作用的功能结合位点,可与多种凋亡调节蛋白(如HK-Ⅰ/Ⅱ、Bcl-2家族蛋白、tubulin、MAP2/4等)以及非蛋白调节因子相互作用,参与调控细胞凋亡.因此,VDAC成为线粒体凋亡通路中一种关键的靶蛋白.本文对近年来VDAC在肿瘤细胞凋亡中的作用机制进行简要综述.     

结核分枝杆菌ICL抑制CTBP1表达并促进细胞凋亡

异柠檬酸裂合酶(Isocitrate Lyase,ICL)参与乙醛酸循环,是结核分枝杆菌能在宿主体内潜伏的关键因素之一.为了探索ICL在结核菌与宿主相互作用中的地位,首先通过酵母双杂交技术在人淋巴细胞cDNA文库中筛选得到一个新的ICL相互作用蛋白CTBP1(C Terminal Binding Protein 1).然后分别采用GST pull-down和Co-IP实验证实了这两个蛋白在体外和体内与ICL相互作用的特异性.通过使ICL在HEK293T细胞中过表达,发现内源性CTBP1在转录水平和蛋白水平的表达都受到了抑制,同时导致细胞增殖减缓、凋亡加快,并出现G2/M期阻滞等改变.这些结果表明,结核菌ICL在参与介导细胞凋亡、影响宿主细胞活性的过程中起着重要的作用.     

利用蛋白质组学技术筛选与BIV基质蛋白MA相互作用蛋白

牛免疫缺陷病毒BIV的基质蛋白MA是由gag基因编码病毒结构蛋白之一,参与病毒运输包装等多种过程.通过蛋白质组学方法,寻找与MA有相互作用的宿主蛋白.通过原核表达MA-CBP融合蛋白,将其结合在几丁质上,并与细胞裂解物混合,纯化特异结合的细胞蛋白.利用双向电泳以及MALDI-TOF质谱分析,筛选到8个与MA具有相互作用的候选蛋白,功能涉及运输、氧化还原、热激反应等.进而克隆所鉴定蛋白之一的PRDX4,利用体外结合实验进一步证实其与BIV MA蛋白存在相互作用.初步建立利用蛋白质组学技术研究病毒与宿主相互作用实验方法,所得结果为了解慢病毒结构蛋白在病毒生活周期中功能提供了线索,有助于探索过氧化物酶家族蛋白在病毒感染过程中的作用及其分子机制.     

酵母双杂交筛选PMEPA1互作蛋白

采用酵母双杂交技术筛选与前列腺跨膜蛋白PMEPA1相互作用的蛋白质,构建了pGBKT7-PMEPA1诱饵质粒,获得与PMEPA1互作蛋白,GST pull-down实验确定2种蛋白间的相互作用.构建了诱饵载体转化酵母菌Y2HGold,对酵母宿主无毒性、无自激活活性.得到阳性克隆Dynactin6,GST pull-down实验证实PMEPA1与Dynactin6蛋白间相互作用.推测蛋白Dynactin6可能参与调控PMEPA1在细胞的运输.     

酵母双杂交技术筛选与Axin相互作用的蛋白质

肿瘤抑制因子Axin以构架蛋白的形式通过Wnt、JNK、p53、TGF-β、G蛋白等众多信号转导途径参与细胞生长、增殖、分化和凋亡等多种重要细胞命运的调控过程.为了发现Axin新的相互作用蛋白,进一步研究Axin的多功能性,作者通过酵母双杂交技术,将Axin1基因从SpeI单一酶切位点到3′末端的DNA序列构建到pGBKT7载体作为诱饵,对小鼠脑的cDNA文库进行筛选,最后获得28个阳性克隆.通过对这些克隆的测序和对所得序列的生物信息学分析,得到13个与Axin的C末端相互作用的蛋白质,这些蛋白主要参与胚胎发育,肿瘤形成,蛋白翻译后修饰等生物学过程的调节.这一结果为进一步研究Axin的新功能提供了很好的线索.     

铜转运蛋白hCtr1结合Cu(I)并转运至铜伴侣蛋白Atox1

铜转运蛋白hCtr1细胞膜内的C端区域对于细胞的铜转运过程具有重要作用,然而这一结构域对铜离子的捕获和胞内蛋白的铜分布机理尚不清楚.为了研究hCtr1蛋白的C端结构域与铜的结合方式,通过紫外-可见吸收光谱、核磁共振谱和质谱等方法,对C端8肽(C8)与铜离子的结合进行了分析.结果表明,一价铜离子对C8有很高的亲和力(log K=16.6).C8能够结合多个铜离子,其HCH基序中的组氨酸和半胱氨酸残基是铜结合位点,而另一个天冬氨酸残基也可能参与铜结合.进一步研究发现,铜离子能够从C8转移到Atox1.实验数据揭示了铜与hCtr1结合的详情,也有助于理解铜在细胞中的分布.     

人类乙型肝炎样病毒核心蛋白中第7位疏水性氨基酸重复肚段区域的突变可以抑制病毒核衣壳的组装

人类乙型肝炎病毒的核衣壳由核心蛋白的二聚体所组成．但是,核心蛋白亚单位与亚单位之间相互作用的机制至今尚不清楚．研究发现,在人类乙型肝炎样病毒──土拨鼠肝炎病毒（WHV）核心蛋白的氨基端,存在着4个保守的疏水氨基酸残基（氨基酸位置101～102）．它们分别是亮氨酸101,亮氨酸108,缬氨酸115和苯丙氨酸122．这4个疏水氨基酸残基以每隔6个氨基酸残基而重复出现1次．它们被称为“第7位疏水性氨基酸重复肽段（hhr）”．由于蛋白质中的疏水键往往在蛋白质的相互作用中起重要作用,因此就在培养细胞系统中研究WHV核心蛋白的hhr区域在…     

Tanis\SelS蛋白的研究进展

Tanis蛋白是一种新发现的由189个氨基酸残基组成的蛋白。研究发现,Tanis蛋白具有胰岛素抵抗的现象,抵抗过氧化氢引起的细胞损伤。Tanis是一种跨膜蛋白,可能作为血清淀粉样蛋白A(SAA)的受体存在,通过与SAA相互作用参与糖代谢。在2型糖尿病、炎症反应、心血管疾病以及代谢性疾病之间建立了连接,为了解这些疾病的发生发展提供了新的研究方向。     

拟南芥RabA2b互作蛋白的筛选与鉴定

Rab蛋白家族在调控细胞囊泡的运输过程中发挥着重要作用.拟南芥中存在数量庞大的RabA亚族成员,它们参与调控植物不同阶段的生长发育过程.为了寻找拟南芥RabA亚族下游的调节蛋白或效应蛋白,进而阐明RabA在细胞活动中的角色,本研究选取RabA2b蛋白进行了深入研究.本研究首先构建过表达RabA2b的拟南芥植株,同时结合免疫共沉淀方法和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测到多个Hsp70蛋白家族成员与RabA2b蛋白共沉淀.为了进一步研究Hsp70成员与RabA2b的相互关系,将5个细胞质和细胞核定位的Hsp70s蛋白分别构建于植物表达载体,通过在烟草叶表皮细胞中瞬时表达Hsp70s和RabA2b发现它们共定位于细胞质膜、细胞质以及细胞核周围的丝状结构.同时,体外pull-down实验证明了5个Hsp70s蛋白都能与RabA2b蛋白直接相互作用.此外,双分子荧光互补实验(BiFC)进一步证实了Hsp70s与RabA2b在烟草叶表皮细胞中的相互作用,说明拟南芥中细胞质和细胞核定位的Hsp70s可以作为RabA2b的调节蛋白或效应蛋白一同调控植物的生长发育过程.     

人类ARF1蛋白的重组表达及其与GDP/ADP的弱相互作用

腺苷酸核糖基化因子1(ADP ribosylation factor 1,ARF1)是一种小G蛋白,负责调控细胞内的囊泡运输,从而影响细胞的生长发育.采用分子克隆的方法构建人类ARF1(hARF1)蛋白的重组质粒pET28a-hARF1,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达纯化,随后利用荧光光谱法和分子对接方法研究hARF1蛋白与嘌呤核苷酸(GDP/ADP)之间的弱相互作用.研究结果表明,重组表达的hARF1蛋白分子质量22 859.29u,与理论值基本一致,其纯度大于95%,产率为5mg/L左右;GDP/ADP与hARF1蛋白弱相互作用的结合常数分别为0.022 69和0.007 71(μmol/L)-1,说明hARF1蛋白选择性地结合GDP,这与细胞内hARF1蛋白只结合GDP的结论一致.     

力经PSGL-1介导ERM蛋白ITAM-like序列上磷酸化位点的暴露

炎症反应阶段,P-选择素糖蛋白配体1(PSGL-1)与埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ERM)的结合在招募脾酪氨酸激酶(Syk)并促进白细胞激活中发挥了重要作用.文中通过晶体结构分析发现,位于ERM蛋白非传统的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM-like)上的两个磷酸化位点(Y191和Y205)周围存在较大的空间位阻,这将阻碍其被Src家族激酶酪氨酸磷酸化继而招募Syk的过程.文中用拉伸分子动力学模拟的方法模拟力学环境下PSGL-1与根蛋白FERM结构域的相互作用,构象分析和残基溶剂可及表面积的变化都表明,经由PSGL-1传导的力学信号可以介导根蛋白ITAM-like序列上磷酸化位点Y205的暴露.文中结果揭示了一条经由PSGL-1胞内域激活Syk的力学信号通路,并且在原子层面上对PSGL-1/ERM/Syk之间的相互作用给予了阐释.     

莱茵衣藻腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的相互作用蛋白组分析

微藻利用光能和CO₂合成淀粉作为藻细胞的储能物质,是以燃料乙醇为代表的液体生物燃料的可持续原料来源.理解微藻淀粉代谢关键酶的催化机制和调控方式是基因工程操作以提高藻细胞淀粉积累能力的前提. 基于此,以莱茵衣藻淀粉合成代谢中的关键酶腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)催化亚基为探针蛋白,获取该酶的GST融合蛋白后使用GST沉降分析实验结合HPLC-MS/MS的蛋白质检测技术及生物信息学分析方法获得一组与AGPase催化亚基存在相互作用蛋白质,主要包含分子伴侣蛋白、光合作用相关蛋白和信号蛋白分子等. 通过综合分析上述蛋白组的生理功能及亚细胞定位,揭示了它们通过与AGPase相互作用在淀粉合成代谢中的生物学意义.      

锌指蛋白去折叠的全原子模拟

锌指蛋白是一种广泛存在于真核细胞的转录蛋白,在生命过程中扮演着重要作用,通过锌离子与特定残基的绑定来维持结构的稳定.作为一种重要的功能结构,锌指蛋白为研究锌离子参与的蛋白质折叠/去折叠问题提供了一个极好的模型.对锌指蛋白去折叠过程进行了原子层次的统计分析.研究发现,锌离子不仅能够稳定蛋白质的天然结构,而且参与了整个去折叠过程;此外,也发现Trp7在残基解离次序方面起着重要的作用.在去折叠的过程中,水分子与去折叠过程的耦合关系表现为驱逐机制.该研究也揭示了金属离子相关蛋白质去折叠过程的一般机制.     

EB1蛋白在调节微管动态、纺锤体定位和染色体稳定性中的作用

EB1(the end-binding protein 1)蛋白家族是一群广泛存在且高度保守的微管相关蛋白,存在于从酵母到人类的广泛的生物体中.它与微管正极和中心体结合,参与了绝大部分基于微管的生理过程,包括:维持细胞极性,调节染色体稳定性,有丝分裂纺锤体的定位,将微管锚定到成核位点.自从1995年,Su等人在人细胞中发现了EB1基因,各种生物体中EB1的同源物质被相继报道.十年来,人们通过对不同生物体的研究,试图揭开EB1在细胞中的分布以及它的生理功能.然而到目前为止,对于EB1的了解还非常有限.本文结合国外的研究成果,对EB1蛋白在调节微管动态、纺锤体定位和染色体的稳定性方面以及它与APC(the adenomatous polyposis coli)之间的相互作用作以综述.     

黑腹果蝇热激蛋白基因家族的生物信息学分析

热激蛋白是细胞或生物体受到热激后新合成的一类遗传上高度保守的蛋白,在生物体中普遍存在,在细胞生长、发育、分化、基因转录等功能方面发挥重要的作用.本研究利用生物信息学方法首次对黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)全部热激蛋白进行分析.结果表明,黑腹果蝇热激蛋白共有HSPC(HSP90)、HSPA(H...     

烟曲霉COFILIN与人GOSR1蛋白相互作用并抑制HEK293T细胞的增殖

COFILIN是真核生物中肌动蛋白的解聚因子,使细胞骨架产生活力.烟曲霉(Aspergillus fumigatus)COFILIN蛋白是其侵入机体的主要致病力因子,也是其逃逸宿主免疫系统防御的重要手段.为了探索烟曲霉COFILIN在感染宿主细胞过程中的作用机制,首先利用酵母双杂交技术在人类巨噬细胞cDNA文库中筛选到了一个新的COFILIN相互作用蛋白GOSR1(Golgi SNAP receptor complex member 1),然后采用GST pulldown和Co-IP技术验证了这两个蛋白在体外和体内相互作用的特异性,并通过将构建的截短突变体转化宿主菌表达的形式确定了相互作用的区段.将烟曲霉COFILIN基因在HEK293T细胞中过表达,结果发现COFILIN对细胞内源性GOSR1在转录水平和蛋白水平的表达都有一定的抑制作用,同时抑制细胞增殖、促进凋亡,并引起G2/M期阻滞.     

HIV-1蛋白酶与抑制剂BEB的结合自由能计算

HIV-1蛋白酶(PR)是治疗艾滋病的重要靶标酶之一.笔者采用分子动力学模拟,运用MM-PBSA方法计算了PR与抑制剂BEB复合物的绝对结合自由能;运用能量分解的方法考察了PR的主要残基与BEB间的相互作用与识别,结果表明:残基GLY27、 ALA28/ALA28'、 GLY49、 ILE50/ ILE50'和ILE84/ ILE84'为PR与BEB的结合自由能提供了主要贡献.抑制剂BEB骨架上的OH基和NH基与残基ASP25/ASP25'、ASP29和GLY27之间的氢键相互作用有利于复合物的稳定.计算结果与实验值吻合较好.     

SARS-CoV-2非结构蛋白Nsp2上调A549细胞泛素水平并被泛素化修饰研究

目的 新型冠状病毒（SARS-CoV-2）因其强大的感染力肆虐全球,因此深入研究病毒与宿主的相互作用是揭示SARS-CoV-2致病机制的重要途经。方法 利用同源重组方法 将SRAS-CoV-2的非结构蛋白Nsp1～Nsp16构建到真核表达载体上,并通过Western blot检测Nsp1～Nsp16重组质粒的蛋白表达情况。接着使用Western blot检测Nsp2对细胞总泛素水平的影响,并通过细胞免疫荧光检测Nsp2在细胞中的分布情况。最后通过免疫共沉淀技术对Nsp2与泛素之间的相互作用关系进行检测。结果 Western blot检测显示Nsp1～Nsp16重组质粒能够在A549细胞中正常表达;筛选发现非结构蛋白Nsp2能在细胞质中上调细胞总泛素表达水平;免疫共沉淀检测进一步发现Nsp2能与泛素蛋白发生相互作用。结论 成功构建了SARS-CoV-2非结构蛋白Nsp1～Nsp16真核细胞表达载体,并发现非结构蛋白Nsp2可以增加细胞总泛素表达水平并被泛素化修饰。提示Nsp2通过泛素途径参与到SARS-CoV-2与宿主的相互作用,有助于深入了解病毒与宿主的作用机制。     

HIV-1 Tat与P-TEFb复合物的分子动力学模拟及结合自由能计算

P-TEFb结构中与Tat蛋白的结合位点是新型抗HIV-1药物设计和虚拟筛选的重要靶标.对含有两个锌指结构的Tat.P-TEFb复合物体系进行了14ns的分子动力学模拟,应用MM-PBSA/GBSA方法计算体系的结合自由能,以及通过基于氨基酸残基的能量分解来探究体系中蛋白质之间的相互作用.结果表明范德华作用能是复合物形成的主要驱动力,Cys261与ZN88之间的配位作用是结合自由能的最大贡献者.根据Tat.P-TEFb体系的动力学结构信息和残基能量分解结果预测了P-TEFb结构中可能的活性位点.位点Ⅰ和位点Ⅱ应可作为基于受体三维结构的抗HIV-1药物分子设计的起始位点.模拟计算的结果可以为进一步指导药物设计奠定基础.     

人原肌球蛋白结合蛋白3(TMOD3)cDNA的克隆及功能初步分析

从人的胎脑cDNA文库到中克隆到1条人原肌球蛋白结合蛋白3（TMOD3）基因,该基因cDNA序列长1402bp,可以编码352个氨基酸残基组成的蛋白,与大鼠,果蝇和线虫的原肌球结合蛋白同源性分别为82％,41％和35％,TMOD3基因定位在人15q21.1-q21.2,位于遗传位标D15S146和D15S117之间,采用基因芯片杂交的方法研究其表达谱概况,发现该基因在多种,组织和细胞中均表达。