基于核酸适配体吸附检测技术的卵形鲳鲹源溶藻弧菌的快速检测

溶藻弧菌是引起广西等华南沿海地区海水养殖鱼类发生细菌性鱼病的主要致病菌之一,其引起的鱼病具有发病迅速、死亡率高、流行面广等特点,严重威胁着华南地区水产养殖业的健康可持续发展。着力发展操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的水产致病菌快速检测技术,对于及早发现、确定病原,进而有的放矢地制定治疗方案来控制病原扩散、降低损失意义重大。在先前研究中,我们基于指数富集的配基系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment technology,SELEX)筛选获得特异性识别卵形鲳鲹源溶藻弧菌的核酸适配体,本研究中我们基于核酸适配体VA8开展溶藻弧菌的快速检测诊断技术的研究,开发出一种新型的能够快速检测溶藻弧菌的核酸适配体吸附检测技术(Aptamer VA8-based enzyme-linked aptasorbent assay,VA8-ELASA),并对VA8-ELASA技术检测溶藻弧菌的特异性和灵敏性进行分析研究。VA8-ELASA技术可以用于溶藻弧菌的快速检测,具有特异性强、灵敏度高的特点。本研究基于核酸适配体VA8建立的新型核酸适配体吸附技术(VA8-ELASA),有望实现对广西卵形鲳鲹养殖中溶藻弧菌病的快速诊断、实时监控和有效预防。     

环境因素对溶藻弧菌HN08155生物膜形成的影响

为了研究不同环境因子对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HN08155生物膜形成的影响,本研究采用改良的微孔板方法,结果显示:在3个不同培养基中,于2216E培养基中生物膜形成的速度最快,与其他实验组存在明显差异;在p H4~9范围内,当p H值为7.0时,溶藻弧菌形成的生物膜量最高;质量浓度为0.5%的Na Cl最适宜溶藻弧菌生物膜的生成,但Na NO3不能促进生物膜的形成;低浓度Ca Cl2可促进生物膜形成,Mg Cl2不参与溶藻弧菌生物膜的生成.由此得出结论:溶藻弧菌生物膜的形成依赖于环境条件,不同环境因子对溶藻弧菌生物膜的形成有不同的影响.     

闽南地区紫石斑(Epinephelus lanceolatus)幼鱼爆发性传染病的病原学研究

应用RT-PCR技术．检测了福建南部石斑鱼育苗场患病紫石斑鱼的病原．结果检出神经坏死病毒；对该病毒的RT-PCR产物进行了核酸测序和序列分析．与基因库中马拉巴斑和紫石斑神经坏死病毒编码病毒核衣壳蛋白的基因片段序列的同源性大于97％．病原菌分离鉴定结果．有2菌株分别是溶藻弧菌和豚鼠气单胞菌．对实验动物有一定的毒力．药敏试验表明这些菌株对常用抗生素表现耐药．临床症状和实验结果都表明．神经坏死病毒感染是导致石斑鱼大批死亡的主要原因．而溶藻弧菌和豚鼠气单胞菌应为继发感染．加重了病情．使更多的石斑鱼死亡．     

拮抗菌对病原性溶藻弧菌粘附大黄鱼鳃粘液的影响

用3H-TdR同位素标记方法研究了分离自患病大黄鱼的溶藻弧菌和健康大黄鱼的7株拮抗菌对大黄鱼鳃粘液的粘附动力学以及拮抗菌对溶藻弧菌粘附的影响,试验结果表明:溶藻弧菌和7株拮抗菌对大黄鱼鳃粘液的粘附都属于饱和粘附;溶藻弧菌对大黄鱼鳃粘液的最大粘附量为4.1×105cells/well,7株拮抗菌的最大粘附量和亲和指数都高于溶藻弧菌;各菌株的分离常数都高于自身的最大粘附量,总体上呈现最大粘附量高的菌株其分离常数也大的趋势.7株拮抗菌在置换条件下都能显著降低溶藻弧菌对鳃粘液的粘附量,在竞争条件下有5株能够显著降低溶藻弧菌的粘附量,在排斥条件下仅有3株能够显著降低溶藻弧菌的粘附.结果表明:病原性溶藻弧菌对大黄鱼鳃粘液有较强的粘附作用;7株拮抗菌能够抑制溶藻弧菌的粘附,其中置换作用效果最好,排斥作用效果最差;拮抗菌和病原菌的粘附动力学特征可在一定程度上反映它们的相互作用效果,但是仅仅根据各菌株自身的粘附动力学特性无法推断其对病原菌粘附的抑制能力.     

鲑点石斑鱼细菌病原的分离鉴定和致病性

对海南省三亚地区网箱养殖的发病鲑点石斑鱼 (Epinephelusfario)进行病原分离 ,通过常规细菌学鉴定和应用ATB半自动鉴定系统及VITEK_AMS_6 0自动微生物鉴定系统 ,并与有关的标准菌株为对照 ,鉴定为溶藻弧菌 (Vibrioalginolyticus)。小鼠毒性实验和不同方式感染鲑点石斑鱼实验的结果表明 ,该菌对小鼠有极强的毒力 ,不同感染方式感染鲑点石斑鱼表现不同程度的致病性。同时测定了溶藻弧菌对小鼠和鲑点石斑鱼的LD50 分别为 3 2× 10 5个 /mL和 2 1× 10 7个 /mL。进一步比较溶藻弧菌对青石斑鱼 (Epinephelusowoara)、真鲷 (Pagrosomusmajor)、平鲷 (Rhabdosargussarba)、黑鲷 (Sparusaurata)、红鳍笛鲷 (Lutjanuserythopterus)、黄斑蓝子鱼 (Siganusoramia)等一些常见海水养殖鱼类的致病性 ,该菌能导致不同海水养殖鱼类死亡并表现一定程度的症状。     

华南地区海水养殖鱼类主要弧菌病原的分离与鉴定

对海南、广东、广西等华南地区的主要海水养殖系统的斜带石斑鱼、红鳍笛鲷、褐点石斑鱼和珍珠龙胆(棕点石斑鱼♀×鞍带石斑鱼♂)等多种海水鱼类的弧菌病开展了流行病学调查,从病鱼体内共分离获得弧菌63株,人工感染试验结果表明,其中4株为强毒株,17株为弱毒株,42株为无毒株.经鉴定,哈维氏弧菌有43株(19株毒力株)、溶藻弧菌7株(1株毒力株)、副溶血弧菌5株、轮虫弧菌2株(1株毒力株)、需钠弧菌1株、无法确定的弧菌属其他细菌5株.     

舟山海域海泥细菌的分离及抗水产病原弧菌的筛选

采集中国东海舟山海域海底不同层次9个海泥样品,通过稀释培养分离纯化得到海洋细菌78株。采用滤纸片琼脂扩散法测定上述分离所得海洋细菌对鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、费氏弧菌等5种水产病害常见病原弧菌的抑制作用,获得具有抑弧菌作用的海洋细菌17株,占21.8%。其中6株菌株对费氏弧菌有明显的抑菌作用,占7.7%。7株菌株对哈维氏弧菌的抑菌作用较显著,占9.0%。2株菌株对创伤弧菌有明显的抑菌作用,占2.6%。2株菌株对溶藻弧菌和鳗弧菌显示一定的抑制作用,各占1.3%。研究结果表明:通过稀释培养法能分离到一定数量和种类的海洋细菌;来自海底泥的海洋细菌中存在较多的具有水产病原弧菌拮抗活性的菌株。     

溶藻弧菌vscO基因在不同环境下的表达差异

为阐明溶藻弧菌vscO的在不同环境下的表达情况,用半定量RT-PCR方法检测vscO mRNA在不同生长时期、不同环境因子（温度、盐度和pH值）培养下的相对表达量.结果表明,溶藻弧菌vscO在对数期,温度为28 ℃,盐度为2%以及培养基起始pH值为7.0时的表达量最高.     

哈维氏弧菌和溶藻弧菌对大黄鱼6种酶活性的影响

以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)和溶藻弧菌(Vibrio anguilarum)分别对大黄鱼(Pseudosciaena crocea)进行病原接种实验,24 h后测定肝、脾、鳃的碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、溶菌酶(Lysozyme,LSZ)和酚氧化酶(Phenoloxidase,PO)活性.结果表明:弧菌入侵24 h后,与吞噬作用相关的水解酶ACP、AKP变化不显著,肝脏溶菌酶LSZ活性降低,出现典型病症,可能是由于应激反应引起非特异性免疫机能下降所致;抗氧化酶CAT、SOD变化显著,对清除代谢产生的活性氧有重要作用;6种酶中,LSZ、CAT、SOD和PO对病原反应敏感,适合作为2种弧菌入侵的检测指标.     

一种水产弧菌快速药敏检测方法的建立

【目的】实现弧菌药物敏感性的现场快速检测。【方法】以副溶血性弧菌、溶藻弧菌及灿烂弧菌3种弧菌为试验菌株,在Mueller-Hinton(MH)培养基基础上通过添加鱼肉蛋白胨及调节无机盐离子浓度,优选弧菌的增菌液。同时利用阿尔玛蓝作为颜色指示剂,选择11种水产常见药物并设置8个倍比稀释的浓度梯度,结合运用海藻糖作为包被保护剂,制备弧菌快速药敏检测微孔板,板内设有药敏检测区、生长对照区及质控区。【结果】利用药敏微孔板法及传统的试管稀释法分别对副溶血性弧菌、溶藻弧菌及灿烂弧菌进行药敏检测,结果显示微孔板法测定的所有药物对3种弧菌的MIC值与试管稀释法完全吻合。【结论】本研究建立的药敏微孔板法能够实现对3种弧菌药敏特性的快速、简便、准确检测,研究结果将为水产病原微生物的现场快速选药技术提供重要参考。     

Plant pathogens. Mitochondrial control of fungal hybrid virulence

Hybrid species of fungal pathogens that infect wild and cultivated plants are emerging with new virulence and host ranges, posing a threat to agriculture and forestry. Here we show that the virulence of hybrid species of the basidiomycete fungus Heterobasidion annosum (Fr) Bref, a causal agent of root and butt rot in conifers and one of the most economically important forest pathogens, is controlled by their mitochondrial genome. Our results indicate that cooperation between organelles that contain genetic information may influence the phenotype of hybrid phytopathogens.     

金黄色葡萄球菌调控基因agr及sae对其耐热核酸酶分泌的影响

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)是一种重要的人畜共患病病原,它能产生一种由nuc基因编码的胞外耐热核酸酶。耐热核酸酶是金黄色葡萄球菌的毒力因子之一,agr及sae位点是编码金黄色葡萄球菌的主要毒力调节因子,研究发现sae调节位点在影响耐热核酸酶的表达上占主导地位。分析金黄色葡萄球菌各毒力因子和金黄色葡萄球菌现有疫苗,为解决金黄色葡萄球菌的耐药性,寻找更好的防治方法,有必要进行探索性实验寻找一种因素或药物,用来阻抑sae调控因子对耐热核酸酶的分泌过程进行调节,从而为金黄色葡萄球菌的防治研究提供一种新材料。     

Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens

Bacterial pathogens operate by attacking crucial intracellular pathways in their hosts. These pathogens usually target more than one intracellular pathway and often interact at several points in each of these pathways to commandeer them fully. Although different bacterial pathogens tend to exploit similar pathway components in the host, the way in which they 'hijack' host cells usually differs. Knowledge of how pathogens target distinct cytoskeletal components and immune-cell signalling pathways is rapidly advancing, together with the understanding of bacterial virulence at a molecular level. Studying how these bacterial pathogens subvert host-cell pathways is central to understanding infectious disease.     

猪的三种新发细菌病研究进展

近几年 ,猪放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪链球菌已成为严重危害规模化养猪业的重要病原菌 ,这些病菌可早期定居感染 ,通过早期断奶等管理措施难以控制。由于其血清型多 ,存在交叉反应抗原 ,缺乏明显的毒力标志 ,这给血清学监测、疫苗制备带来困难。本文就这三种病菌的致病性、流行病学特点及其控制做一综述。     

一株海洋蛭弧菌类生物对海水细菌的生物控制和水质的影响

 研究了一株海洋蛭弧菌类生物(Bdellovibrio-and-like organisms,BALOs) DA5与溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）在海水中共培养时的相互作用;并研究了DA5对添加营养的自然海水中细菌的生物控制效果及对水体pH、化学需氧量(COD)、氨氮(NH₃-N)和亚硝酸氮(NO₂-N)含量的影响。结果表明DA5在振荡培养条件下对溶藻弧菌具有明显的裂解作用,较高的感染比有助于快速减少寄主菌,但长时间的共培养也不能完全清除溶藻弧菌。DA5对自然海水中异养细菌和弧菌均有一定的清除作用,且对弧菌的消减作用更明显,但对水体pH、COD、NH₃-N和NO₂-N含量均无显著影响,且BALOs含量总体上与细菌或弧菌的含量呈正相关。     

2种弧菌鞭毛蛋白的分离纯化与鉴定

尝试分离提取2种弧菌的鞭毛蛋白,采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳对所提蛋白进行分离纯化,Western免疫印迹检测,电镜鉴定。结果显示：实验已经成功分离提纯了哈维氏弧菌的鞭毛蛋白,获得了溶藻弧菌鞭毛蛋白的初提液。提纯的哈维氏弧菌鞭毛蛋白经SDS-PAGE显示3条清晰蛋白带（相对分子量分别为39.7,41.9和42.7KDa）,透射电镜观察表明该蛋白呈经典的丝状,可以认为哈维氏弧菌的鞭毛丝是由相对分子量分别为39.7,41.9和42.7KDa的3种鞭毛蛋白亚基构成。溶藻弧菌鞭毛蛋白的初提液经SDS-PAGE后显示5-9条蛋白带,其中36.8KDa的蛋白带有强的免疫原性。     

杀虫防菌Bt工程菌的构建

N-乙酰高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserine lactones,AHLs）是革兰氏阴性细菌胞间通讯的信号分子,能够调控许多植物病原菌的致病基因的表达,但如果内酯酶将其水解,则会影响病原菌的致病活性,植物就不会染病。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）,作为生物杀虫剂已有多年使用的历史,本研究通过生物技术手段成功地构建了携带信号分子AHL水解酶基因的穿梭载体pHTss10304,并转入到具有Bt中,构建成工程菌Bt24、工程菌Bt33、工程菌Bt34和工程菌Bt36。通过设计,实现了Bt工程菌的多功能改造,为BT工程菌的应用提供了更为广阔的空间,为生物防治菌的开发现有菌剂提供了新的思路。     

The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth

Bacterial virulence determinants can be identified, according to the molecular Koch's postulates, if inactivation of a gene associated with a suspected virulence trait results in a loss in pathogenicity. This approach is commonly used with genetically tractable organisms. However, the current lack of tools for targeted gene disruptions in obligate intracellular microbial pathogens seriously hampers the identification of their virulence factors. Here we demonstrate an approach to studying potential virulence factors of genetically intractable organisms, such as Chlamydia. Heterologous expression of Chlamydia pneumoniae CopN in yeast and mammalian cells resulted in a cell cycle arrest, presumably owing to alterations in the microtubule cytoskeleton. A screen of a small molecule library identified two compounds that alleviated CopN-induced growth inhibition in yeast. These compounds interfered with C. pneumoniae replication in mammalian cells, presumably by 'knocking out' CopN function, revealing an essential role of CopN in the support of C. pneumoniae growth during infection. This work demonstrates the role of a specific chlamydial protein in virulence. The chemical biology approach described here can be used to identify virulence factors, and the reverse chemical genetic strategy can result in the identification of lead compounds for the development of novel therapeutics.