利用Ti质粒介导的二元载体法向小麦导入几丁质酶 …

以小ＮＰＦＤ、９４－１６７、鄂恩一号３个品种的幼胚，幼穗为受体材料，利用Ｔｉ质粒介导的二元载休不幸针含有几丁质酶基因的质粒ｐＢｃｈ导入小麦，经过抗性筛选，ＰＣＲ检测，获得一株基因小麦，证实了外源几丁质酶基因已整合到小麦基因组中。     

几丁质酶基因在转基因烟草中表达效率的检测

采用氨基葡萄糖法检测转基因烟草植株叶片几丁质酶活力，结果表明几丁质酶基因在转基因植株中酶活力增强，与β—1,3-葡聚糖酶基因的协同作用下酶活性最强，几丁质酶活力的测定对外源基因表达效率的检测是可行的．     

天冬氨酸酶基因工程菌质粒pXZ70的稳定性

将ｐＳＣ１０１质粒上的Ｐａｒ区域（控制质粒分配的基因座）克隆到含有天冬氨酸酶基因的质粒ｐＸＺ７０上，构建成重组质粒ｐＺＺ１，将ｐＺＺ１质粒转化入大肠杆菌ＪＭ１０９细胞中，得到一株质粒可稳定遗传的重组子细胞，培养１００代后，含质粒菌数仍在９０％以上。     

抗黄矮病小麦易位系cDNA文库的构建

对小麦-中间偃麦草易位系HW642一周龄幼苗接种饲黄矮病毒蚜虫,接种48 h后取幼叶提取mRNA构建了一个cDNA文库,文库的滴度为1.5×105pru/mL.随机挑取103个重组克隆,用限制内切酶EcoR I、Xho I消化,统计分析结果表明插入片段在150～4000 bp之间,平均插入片段大小为2000 bp左右,重组率为95.15 ％.文库可用于筛选抗病候选基因及EST研究等.     

C_3启动子克隆及荧光素酶报告基因载体构建

为克隆C_3基因启动子序列,构建C_3基因启动子荧光素酶报告基因载体,运用PCR的方法从血液中提取到的基因组DNA中获得目的基因,双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体上,构建C_3基因启动子报告基因载体.构建的pGL3-Basic-C_3-promotor重组质粒和内参质粒SV40瞬时转染Hela细胞,检测荧光素酶活性.结果表明,PCR扩增出C_3基因启动子片段;双酶切及测序鉴定重组体构建正确;转染Hela细胞后经双荧光素酶报告基因检测确定重组体有启动子活性.成功构建了C_3启动子报告基因载体,在细胞系中进行初步活性分析得知所克隆的C_3基因调控序列包含启动子活性区域.     

斑马鱼loc558117基因的多克隆抗体制备

loc558117基因是trim45在斑马鱼中的同源基因,小鼠及果蝇研究结果表明该基因与血细胞发育有关.利用PCR技术扩增斑马鱼loc558117基因部分编码区,并将其插入到原核表达载体pET-28a中,经过酶切和测序鉴定后,将重组质粒(pET-28a-loc558117)转入Rosseta感受态细胞,通过IPTG诱导...     

重组质粒DNA的提取和纯化方法研究

质粒ＤＮＡ的提纯是现代分子遗传学和基因工程的重要技术，本实验对质粒ＤＮＡ的提取和纯化方法进行了比较研究，并通过改进，建立了简便，快速提取和纯化质粒ＤＮＡ的方法，利用此法所提质粒ＤＮＡ收率大，纯度高，能适于细菌转化，细胞转染及酶切分析等进一步实验研究。     

拟南芥FIE基因特异片段的克隆及序列测定

根据拟南芥FIE基因的序列设计PCR引物,以拟南芥基因组DNA为模板,通过PCR反应扩增FIE基因特异性片段,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,长为1633bp,与预期结果相符。将该基因片段定向克隆到pGEM-T载体上,得到重组质粒p1633,酶切鉴定及测序分析结果表明该克隆为拟南芥FIE基因特异片段,与拟南芥FIE基因比较同源性达99.8％,可以作为探针使用。     

果蝇血液标记基因srp原核表达质粒构建及多克隆抗体制备

果蝇基因srp是血液发育的早期标记基因,为了研究果蝇这一模式动物中血液发育的详尽过程,通过提取野生型成体果蝇的总RNA,反转录获得其cDNA文库,设计引物克隆出srp基因,将所得片段插入原核表达载体pET28a中,经酶切和序列鉴定,成功构建重组质粒,并通过IPTG诱导表达出His-srp融合蛋白,经Ni-IDA凝胶柱纯...     

果蝇血液发育标记基因mrj的多克隆抗体制备及检测

mrj是黑腹果蝇中一个蛋白编码基因.根据已报道的mrj基因序列,利用生物信息学分析选取果蝇mrj基因抗原亲水区,通过PCR扩增出其部分编码区序列,将其连接到pET-28a原核表达载体上.经酶切及测序鉴定质粒构建成功后,将重组质粒(pET-28a-mrj)转入Rosetta菌后通过IPTG(Isopropy1β-D-thiogalactoside)诱导表达出带His标签的重组融合蛋白后用镍柱纯化.将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体的效价和特异性.     

竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶的表达载体的构建及重组蛋白抗肿瘤的研究

将经BamHⅠ和HindⅢ酶切的pMD18-T-LAAO和Pet28a(+)质粒的纯化回收产物进行连接,将产物Pet28a(+)-LAAO表达载体转化BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物经Western-blot分析表明,重组蛋白能被兔抗竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶(LAAO)阳性血清所识别.将鼻咽癌CNE-2Z、人宫颈癌LYA01021和卵巢癌A2780MSC细胞悬液接种小鼠建立小鼠实体瘤模型,分别用不同浓度重组蛋白接种荷瘤小鼠,根据瘤重和小鼠存活时间计算抑瘤率和对荷瘤小鼠生命延长率.结果表明:重组蛋白对低、中和高剂量组荷瘤小鼠抑瘤率和生命延长率与阴性对照组均存在极显著差异(P<0.01).本研究为开发利用竹叶青蛇毒L-氨基酸氧化酶提供依据,为进一步研制新型的抗肿瘤药物打基础.     

nodD基因的克隆及其导入大豆根瘤菌工程菌株的构建

以快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067的基因组DNA作为模板,采用PCR技术,克隆结瘤基因nodD编码区序列;利用DNA重组技术,将nodD基因连到lac启动子的下游,通过luxAB基因标记的质粒载体pTR102构建表达载体pTR102-Plac-nodD,采用三亲本杂交的方式,将构建的表达载体转化土著大豆根瘤菌,构建转基因工程菌株,为研究转基因工程菌株对大豆结瘤能力的影响提供依据。     

导入额外拷贝dctA基因的根瘤菌工程菌株的构建

为进一步提高大豆根瘤菌的固氮能力,以费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)15067基因组的DNA作为模板,采用PCR扩增技术,克隆四碳二羧酸转移酶结构基因dctA的全长序列;将其连入lac启动子下游,构建带有LuxAB基因标记的pTR-Plac-dctA重组表达载体。利用三亲本杂交技术将表达载体转入费氏中华根瘤菌中,构建大豆根瘤菌工程菌株。研究表明,转基因工程菌株侵染大豆幼苗后与出发菌相比,固氮酶活性有了显著提高,为提高大豆产量的研究提供一定参考。     

ph突变体和电离辐射在太谷核不育小麦研究中的利用

太谷核不育小麦自1972年被发现以来,人们在对它的理论研究和实际应用等各方面都开展了大量的研究工作。本文通过核不育小麦与“中国春”ph突变体杂交的方法,选育带ph突变基因的太谷核不育小麦,并以蓝粒小麦为供体,利用电离辐射方法对核不育小麦籽粒附加标记性状进行了初步探索,统计了携带Tal基因的4D染色体和控制篮胚乳性状的4E染色体在双单体情况下通过雌配子的传递频率。同时对蓝粒小麦、太谷核不育小麦、“中国春”ph突变体及杂交各代进行了细胞学观察,并在此基础上对太谷核不育小麦雄性不育性的原因以及在诱发染色体易位进行基因转移的过程中,利用ph突变体和电离辐射两种方法的特点及应用进行了研究和讨论。     

壳聚糖酶、纤维素酶降解壳聚糖的研究

研究了壳聚糖酶和纤维素酶催化降解壳聚糖,讨论了温度、pH等因素对壳聚糖降解的影响,并得到最佳的反应条件.研究了壳聚糖酶和纤维素酶的热稳定性,以及pH对酶的稳定性的影响.讨论了底物浓度和酶浓度对壳聚糖降解的影响,适当增加底物浓度和酶的浓度,能够加速壳聚糖的降解.     

果蝇nulp1特异性多克隆抗体制备及检测

为了利用果蝇模型研究nulp1蛋白在早期心脏发育中的功能,采用PCR技术扩增出果蝇nulp1基因的部分编码区并插入到pET28a表达载体中.之后将重组质粒转入大肠杆菌(E.coli)Rosetta( DE3);通过IPTG诱导表达His-nulpl融合蛋白,该融合蛋白采用Ni2+金属螯合层析纯化后,免疫新西兰兔制备了多...     

利用实时荧光定量PCR技术检测转基因烟草

本实验通过荧光染料掺入dsDNA实时监控扩增产物的积累,根据质粒标准品的ct值制成标准曲线,结合标准曲线方程可知未知样品的起始含量,该方法灵敏度高、快捷,可用于基因突变和转基因植株的检测、病毒的检测、遗传疾病和肿瘤疾病的诊断。     

抗汞菌株的筛选及质粒的研究

测定了自污染地区分离到的抗30μg/mL HgCl_2的87株细菌中有39株具有质粒带,将它们分为4种类型,其中汞盐抗性质粒可以转移。其抗性不只是由质粒决定,还受核基因控制。探讨了对不同菌株的质粒进行消除的方法。     

LL-37/hCAP-18基因克隆及其真核表达载体的构建

LL-37 hCAP-18是一种重要的多功能免疫分子.为探讨hCAP-18在基因治疗中的可行性,应用RT-PCR技术从人白血病细胞系J6-1细胞总RNA中成功扩增出560bp的hCAP-18基因编码区cDNA序列,构建了hCAP-18重组表达质粒phCAP-18.采用脂质体法将质粒phCAP-18瞬时转染COS-7细胞,Westernblot证实,hCAP-18能在COS-7细胞中表达.