假单孢菌PKE117木素过氧化物酶的酶学性质及基因克隆

对纯化得到的假单孢菌PKE117的胞外木素过氧化物酶的酶学性质进行了初步研究,发现其最适pH为5.0,最适温度为30℃,以藜芦醇为底物,在25℃,pH3.0的琥珀酸钠缓冲液中与底物反应时的Km值为(0.277±0.0008)mmol/L,vmax为(0.049±0.001)mmol.mg-1protein.min-1。根据LiP已知保守序列设计引物,提取质粒,扩增得到一条199bp的DNA片段lip1和一条563bp的DNA片段lip2,序列比对结果显示与已报道的白腐真菌过氧化物酶基因的同源性不是很高。核苷酸翻译后的氨基酸序列比对结果发现,LiP1与Pycnoporus sanguineus的漆酶的同源性达到100%,与Mycobacteriumbovis的木素过氧化物酶的同源性达到80%;LiP2与Arabidopsis thaliana的过氧化物酶同源性达到100%,与Hordeumvulgare的过氧化物酶1同源性为75%。     

假单孢菌PKE117木素过氧化物酶的酶学性质及基因克隆

对纯化得到的假单孢菌PKE117的胞外木素过氧化物酶的酶学性质进行了初步研究,发现其最适pH为5.0,最适温度为30℃,以藜芦醇为底物,在25℃,pH3.0的琥珀酸钠缓冲液中与底物反应时的Km值为(0.277±0.0008)mmol/L,vmax为(0.049±0.001)mmol·mg-1 protein·min-1.根据LiP已知保守序列设计引物,提取质粒,扩增得到一条199bp的DNA片段lip1和一条563bp的DNA片段lip2,序列比对结果显示与已报道的白腐真菌过氧化物酶基因的同源性不是很高.核苷酸翻译后的氨基酸序列比对结果发现, LiP1与Pycnoporus sanguineus的漆酶的同源性达到100%,与Mycobacterium bovis的木素过氧化物酶的同源性达到80%;LiP2与Arabidopsis thaliana的过氧化物酶同源性达到100%,与Hordeum vulgare的过氧化物酶1同源性为75%.     

苦瓜过氧化物酶的提取分离及性质测定

从苦瓜(Momordica charantia L.)中分离和纯化过氧化物酶(POD),分别测定其最适pH值、最适温度、热稳定性、底物浓度对酶活性的影响。结果表明:苦瓜过氧化物酶以邻苯二胺为底物时λmax=425nm,Km=4.6×10-3,Vmax=0.137unit/s,最适pH值为4.6,最适温度是50℃。在温度为50℃时过氧化物酶的酶活力最大,酶活性较高。在温度为60℃以上时过氧化物酶的失活率升高,在温度为70℃以上时过氧化物酶基本失活。抗坏血酸和半胱胺酸对过氧化物酶有明显的抑制作用,其失活率分别达到94%和92%;Al3 的抑制作用稍弱,过氧化物酶的失活率为69%;EDTA的抑制效果最不明显,过氧化物酶的失活率仅为13%。     

黄孢原毛平革菌低温产酶条件优化及酶学性质研究

以酶活力为评价指标,在10℃对黄孢原毛平革菌产酶条件进行优化,并对其部分酶作用特性进行了研究.结果:该菌在10℃下产LiP、MnP和Lac的最佳碳源是葡萄糖,最佳氮源是牛肉膏,最佳培养时间是72~108 h.LiP、MnP和Lac的最适反应pH范围均为4.4~4.8,最适底物浓度是0.8~1.2 mmol/L;金属离子Cu2+,Ca2+对LiP、MnP和Lac有激活作用.Fe2+对三种酶活有一定的抑制作用;而Na+则完全抑制LiP的活性,Zn2+、Mg2+对三种酶活影响不大.     

白蚁肠道木质素分解菌PY12的分离鉴定及lip基因的克隆

利用苯胺蓝平板法从白蚁肠道中分离到一株木质素分解高效菌株PY 12,经形态观察、生化鉴定和16 SrRNA鉴定为肠杆菌属的霍氏肠杆菌(Enterobacterhormaechei).根据已报道的lip(木质素过氧化物酶,Lignin Peroxidase)基因序列设计特异性引物,克隆该菌的lip基因,将其克隆入pMD19-T载体,获得的核苷酸序列为918 bp,并与GenBank中已知的lip序列进行同源性对比,同源性不高,但该核苷酸翻译后的氨基酸序列比对结果发现,其与假单胞杆菌Pseudomonas sp.编码蛋白质的氨基酸序列同源性为88.5%.     

新型Ⅰ型普鲁兰酶基因的克隆表达及酶学性质

【目的】筛选并克隆表达高酶活且具有一定热稳定性的新型普鲁兰酶。【方法】克隆Tumebacillus flagellatus GST4的普鲁兰酶基因pulB,构建重组质粒后转化宿主菌大肠杆菌进行诱导表达,再运用亲和层析进行纯化并分析其酶学性质和结构。【结果】pulB在大肠杆菌中实现可溶性表达,发酵液上清酶活力达到78U/mL,粗酶液经纯化后比活力为258U/mg。重组酶PulB最适反应温度和pH值分别为55℃和5.0,在较窄的酸性范围内(pH值4.5~5.5)酶活力比较稳定;对普鲁兰糖的Km=(16.28±0.03)mg/mL,Vmax=(22.05±0.02)μmol·min-1·mg-1。PulB的DNA序列与GenBank数据库里的任何序列都没有同源性,在蛋白质序列上,由基因pulB编码的氨基酸序列与T.aegyptius的环麦芽糖糊精酶相似性最高,BlastX比对的Identities为54%,Positives为69%,SMART结构预测分析发现,pulB具有淀粉酶的结构域。底物特异性分析表明,它可水解普鲁兰糖和支链淀粉生成线性的低聚糖或麦芽三糖。【结论】重组酶PulB是尚未报道的新型普鲁兰酶,它可水解普鲁兰糖和支链淀粉,属Ⅰ型普鲁兰酶。     

齿毛菌漆酶的基因克隆、异源表达及脱色研究

通过简并PCR、TAIL-PCR、Site Finding PCR等方法从实验室前期筛选得到的一株齿毛菌中获得漆酶Lac基因(包括启动子)序列,将其c DNA转入Pichia pastoris X33中表达,以ABTS(2,2-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))为底物测定温度和p H对酶活及其稳定性的影响,并探究重组漆酶的脱色效果.结果表明,Lac DNA长3 129 bp,含有10个内含子,编码的Lac蛋白共有542个氨基酸,与已知漆酶氨基酸序列的相似性最高为60%,在5’端950 bp序列内发现多个可能的启动子元件;成功分泌表达重组漆酶r Lac,在含1 mmol·L-1铜离子的YP培养基中28℃发酵15 d达到酶活最高峰2.89 U·m L-1;酶学性质研究发现,r Lac的最适作用温度和p H值分别为55℃和3.0,且在p H 4~10及20~40℃有较好的稳定性;r Lac对靛类、偶氮类、三苯甲烷类等多种染料都有脱色效果.     

秀珍菇废渣中木质素降解酶系的研究

【目的】重点研究秀珍菇废渣中的木质素降解酶系。【方法】对秀珍菇废渣中可能存在的3种木质素降解酶:锰过氧化物酶(Manganese peroxidase,MnP)、木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase,LiP)及漆酶(Laccase,Lac)进行活力测定,并对漆酶的最适pH值和最适温度进行考察。【结果】在秀珍菇废渣中未检测到锰过氧化物酶活力,检测到漆酶和木质素过氧化物酶活力。漆酶的最适pH值为6.2,最适温度为30℃。【结论】较一般食用菌不同,秀珍菇废渣中同时具有木质素过氧化物酶和漆酶活力,并且木质素过氧化物酶活力还较高。     

Klebsiella sp.GXK-1的α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质

【目的】克隆、表达克雷伯氏菌Klebsiellasp.GXK-1菌株中的α-L-鼠李糖苷酶基因,并研究重组酶的酶学性质。【方法】比对分析GenBank数据库中克雷伯氏菌同属的α-L-鼠李糖苷酶基因序列,设计简并引物PCR扩增基因的保守区。扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒pSE-rha1,并在大肠杆菌E.coli XL-blue进行诱导表达,使用镍亲和层析纯化重组蛋白,研究目的蛋白RHA1的酶学性质。【结果】以pNPR为底物,进行重组酶酶学性质的研究。重组酶RHA1的最适pH值和最适温度分别为5.0和45℃,Km值为(0.223±0.030)mmol/L,V_(max)值为(1.272±0.121)μmol/(min·mg)。在pH值为6~10的缓冲液内酶活力仍保持在80%以上;在温度为40℃以下时,酶活较为稳定,但在温度高于40℃时酶活力迅速下降。RHA1能水解pNPR、橙皮苷和芦丁。【结论】RHA1具有良好的pH稳定性,不仅能够水解人工底物pNPR,还能够水解α-1,6键的天然底物橙皮苷和芦丁,具有一定的医疗应用价值。     

产结晶纤维素酶的嗜热菌鉴定及其酶学性质

从云南腾冲热海温泉采集的样品中,分离出一株产结晶纤维素酶的嗜热菌TC-1.该菌株呈杆状,革兰氏阴性,生理生化特征分析和16S rDNA序列同源性比对表明它属于亚栖热菌属Meiothermus.结晶纤维素、木聚糖和葡萄糖可以诱导该菌产生结晶纤维素酶,其中结晶纤维素诱导的酶活力最高.对其产生的结晶纤维素酶进行了初步纯化与酶学性质研究,该酶的最适反应温度为70℃,最适pH为6.0,在50℃～70℃和pH5.5～6.5之间酶活力相对稳定.