重组果蝇Merlin蛋白的表达与纯化

NF2基因的的缺失会导致Ⅱ型多发性神经纤维瘤的发生.NF2又称Merlin,和ERM蛋白家族成员类似,Merlin蛋白N端的FERM结构域与C端的CTD结构域存在分子内的相互作用,从而形成一种自抑制的闭合构象;当Merlin蛋白N、C端分子内的相互作用被破坏时,能释放出N端的FERM结构域,从而能与许多效应因子相互作用...     

GST-Jab1融合蛋白表达载体的构建及表达纯化

目的获取GST-Jab1蛋白,进一步研究Jab1的功能。方法以pMSCVneo-Jab1为模板,PCR扩增Jab1 DNA片断,EcoRI和XhoI双酶切后克隆至pGEX-5X-1表达载体,测序验证。将正确重组的pGEX-5X-1-Jab1表达质粒转化E.coli BL21,IPTG诱导后,超声破碎细胞,用GST琼脂糖珠对上述表达产物进行纯化,SDS-PAGE、Western Blot分析和鉴定诱导表达和纯化的GST-Jab1蛋白质。结果成功构建了pGEX-5X-1-Jab1重组表达载体,SDS-PAGE分析结果显示表达和纯化的蛋白质与融合蛋白GST-Jab1预期分子量一致,Western Blot鉴定结果证实纯化的蛋白质为GST-Jab1。结论成功地表达、纯化了GST-Jab1融合蛋白。     

类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性

目的 构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELP-mCherry融合蛋白,探讨ELP-mCherry融合蛋白与细胞的相容性.方法 对利用限制性内切酶Xba I和Xho I对mCherry质粒和pET28a-ELP载体同时进行双酶切,将酶切产物回收、连接并转化DH5α大...     

重组人附睾特异蛋白BDFx的优化表达与纯化

通过改变异丙醇-β-D硫代半乳糖苷诱导浓度、诱导温度及诱导培养时间,优化含重组人附睾特异蛋白BDFx工程菌的表达条件．运用DEAE阴离子与CM阳离子交换层析及S-100分子筛层析纯化重组蛋白,用基质辅助激光解吸离子化-飞行时间质谱法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、紫外扫描等方法鉴定目的蛋白．结果显示,缩短诱导培养时间、降低IPTG浓度等可提高重组蛋白的表达量,表明适当提高诱导表达温度不会形成包涵体,并可缩短表达时间．     

绿色荧光蛋白结合蛋白的表达纯化与鉴定

绿色荧光蛋白(GFP)及其衍生物已经被广泛应用于生物化学和分子生物学研究,其纳米抗体(GBP)也已在近期被鉴定,但GBP大规模表达及纯化流程优化尚未见报道,并且GBP与不同荧光蛋白之间的亲和力尚未被测定.我们首先构建了GBP基因(GBP1)的原核表达系统,然后通过Ni-NTA亲和层析和Mono Q阴离子交换层析纯化,每升菌液能够得到超过43mg、纯度超过95%的重组GBP1蛋白.我们通过MALDI-TOF/TOF质谱法测定纯化的GBP1的精确分子量,通过微量热泳动(MST)和等温滴定量热(ITC)实验检测GBP1与7种不同来源荧光蛋白的亲和力.结果显示GBP1特异性地与源自Aequorea victoria的荧光蛋白及其衍生荧光蛋白相互作用,与RFP和Zoanthus GFP等无相互作用.GBP1与EGFP和sfGFP的亲和力最高,与YPet和T-Sapphire的亲和力稍弱,与CyPet的亲和力最低.     

重组植物AHA2蛋白的真核表达及纯化研究

AHA2蛋白位于植物细胞细胞质质膜上,该蛋白在原核蛋白表达体系中无法重组表达.已经报道的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）表达体系操作复杂、成本高昂.本文利用RT-PCR、分子克隆等技术构建了植物AHA2蛋白的真核表达载体,并利用毕赤酵母（PiChia）对AHA2蛋白加以表达.利用亲和层析和分子筛层析相结合的方法,获得了高质量的处于高活性态的目的蛋白.     

水稻类非特异脂质转移蛋白OSDIR的表达和纯化

通过PCR方法从水稻(O ry za sa tiva)染色体基因组中扩增一个编码非特异性脂质转移蛋白(nonspec ific lip id transfer prote in,nsLTP)类似蛋白的基因(OSd ir),将该基因片段克隆到硫氧还蛋白融合表达载体pET 32a( )中后,在BL 21(DE 3)trxB-宿主菌中实现了融合蛋白的高表达,表达产物为包涵体。利用尿素溶解包涵体并复性后,再通过Sepharose N i2 -che lating fast flow柱亲和纯化融合蛋白,得到重组O SD IR蛋白。     

利用天然油体纯化原核表达蛋白的方法研究

以脂肪酶为例,探索一种利用天然油体纯化原核表达蛋白的新方法.将已经构建的脂肪酶和油体蛋白基因的融合表达载体(pET32a-Jco2-Xa-LipA),在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.提取植物天然油体在超声条件下与原核表达蛋白重构,由于油体蛋白的强疏水性和脂肪酶亲水性特性可以使得油体标记的脂肪酶固定在油体的表面.通过Factor Xa消化油体蛋白和脂肪酶之间的链接Linker后,通过离心分离,可快速实现脂肪酶的纯化.     

耐热碱性磷酸酯酶(TAPND27)的表达、纯化和性质测定

通过分离纯化和酶学性质测定,确定耐热碱性磷酸酯酶（ＴＡＰＮＤ２７）为八聚体,最适反应温度为６５℃,在９９℃保温３０ｍｉｎ仍保留４９．４％的活性,在质量分数为５％的Ｔｗｅｅｎ２０体系中依然有７０％以上的酶活性,并且有很宽的ｐＨ稳定范围。这表明ＴＡＰＮＤ２７适合在高温条件和高浓度去污剂的体系中应用。     

人FOXA1蛋白的原核表达、纯化及蛋白互作分析

构建FOXA1的原核表达载体,诱导表达并纯化后获得人FOXA1的C端和N端蛋白片段,为寻找FOXA1的互作蛋白提供材料基础.提取人乳腺癌细胞MCF7的总RNA,逆转录成cDNA,设计引物PCR克隆FOXA1的cDNA,再以此为模板扩增FOXA1的C端、N端cDNA片段,分别并克隆进带有GST标签的原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒.双酶切及测序鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21Rosetta DE3,经IPTG诱导,Glutathione Sepharose 4B亲和纯化,通过SDS-PAGE电泳及Western blot确定FOXA1蛋白的表达.与MCF7细胞裂解液孵育,进行GST-Pull down试验,检测纯化蛋白与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.成功构建pGEX-4T-1-FOXA1-C和pGEX-4T-1-FOXA1-N的原核表达载体;在大肠杆菌中诱导目的蛋白表达;经Glutathione Sepharose 4B纯化后,获得了人FOXA1的C端蛋白片段GST-FOXA1-C与N端蛋白片段GSTFOXA1-N;证实GST-FOXA1-C能与FOXA1已知互作蛋白TLE3的相互作用.     

人细胞周期蛋白D1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

将人细胞周期蛋白D1全长cDNA克隆入原核表达载体pET-28c(+)中, 经酶切和测序鉴定正确的重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后获得表达菌株. 该菌株经IPTG诱导高效表达出带有组氨酸标签的以包涵体形式存在的融合蛋白, 表达量占菌体总蛋白的23%. 包涵体经洗涤和溶解， 在变性条件下利用Ni²⁺螯合柱纯化、 尿素梯度复性后， 得到纯度达98%以上的纯化蛋白. SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为43 ０００， Western-b lot分析表明， 在相应分子量处有一特异性条带， 说明成功表达和纯化重组人细胞周期蛋白D1.     

禽流感病毒H5N1亚型RNA聚合酶蛋白表达纯化及晶体生长

通过使用原核表达载体大量表达H5N1病毒RNA聚合酶亚基PA-C257,PB1_N25,再经过GST亲和层析和Sephadex G-200层析柱纯化,获得了高纯度的蛋白复合体.采用悬滴气相扩散法筛选蛋白晶体,在1～1.5mol/L乙酸钠和pH7.9条件下获得了理想的晶体,为解析禽流感病毒RNA聚合酶三维结构并进一步认识其生物功能奠定了基础.     

rhBMP-6的表达和纯化

骨形态发生蛋白(bone　morphogenetic protein，BMP)—6属于转化生长因子(transforming growth fac-tor)—β超基因家族，在骨的形成中具有重要作用，并受雌激素选择性上调．本研究利用RT—PCR从人胎盘组织中扩增BMP—6成熟肽的DNA片段，克隆到pGEx—5x—1中，构建GST—BMP6融合蛋白表达载体pGEx—BMP—6，转化E.coli DH5a．克隆质粒转化的工程菌，经IPTG诱导4h后，高效表达GST—BMP6融合蛋白，在SDS—PAGE上出现一新蛋白带，分子量约为42kD，约占总蛋白的25％，表达产物以包涵体形式存在．菌体超声破碎，经0．3％N—十二烷基肌氨酸钠(SKL)溶解包涵体，离心后的上清液加入0．6％　Triton　x—100整合SKL，然后利用谷胱甘肽Sepharose—4B亲和层析纯化．结合GST—BMP6的介质经洗涤、xa因子酶切得到纯度达95％的rhBMP—6蛋白。     

大肠杆菌分子效伴侣GroEL和GroES蛋白的高效表达、纯化与鉴定

研究分子伴侣对解决蛋白质折叠的理论问题及基因工程包涵体的实际问题是很有用的。本文讨论的是Ｅ．ｃｏｌｉ的分子伴侣－属于ｈｓｐ６０家族的ＧｒｏＥＬ蛋白及其辅助蛋白ＧｒｏＥＳ。重组质粒ｐＧｒｏＥＳＬ含有大肠杆菌的ｇｒｏＥＬ和ｇｒｏＥＳ基因。利用这个表达载体，经摇瓶发酵，ＩＰＴＧ诱导表达大量的ＧｒｏＥＬ和ＧｒｏＥＳ蛋白。破菌后，上清经ＤＥ５２—ｃｅｌｕｌｏｓｅ柱层析，硫酸铵分级沉淀，ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００和ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱层析，得到纯度分别为８５％和８０％的ＧｒｏＥＬ和ＧｒｏＥＳ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示ＧｒｏＥＬ和ＧＳ蛋白亚基的分子量与理论值相符，同时还定到了ＧｒｏＥＬ蛋白的ＡＴＰ水解酶活力。这种纯化方法操作简单，重复性好，并且可同时得到ＧｒｏＥＬ和ＧｒｏＥＳ蛋白。这两种蛋白可进一步用于体外变性蛋白重折叠的研究     

基因重组人骨形成蛋白4成熟肽在大肠杆菌中的大规模发酵表达及纯化

含有编码人骨形成蛋白4成熟肽(Bone morphogenetic protein 4 mature peptide,hBMP-4m)cDNA表达质粒的菌株,经50代传代,质粒不丢失,仍然稳定高表达hBMP-4m。将此菌株导入15 L NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵、诱导表达,测定发酵菌液OD600值为43.5,离心收集菌体,PAGE电泳结果hBMP-4m占细菌总蛋白量的39％。悬浮所收集的菌体、裂菌,洗涤后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的85％。将少量包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解分别上SP阳离子和Q阴离子交换柱,用连续盐浓度的洗脱液洗脱蛋白,收集各蛋白峰做蛋白电泳分析,找到洗脱液的最合适盐浓度。然后将全部包涵体用8 mol尿素缓冲液溶解,上阳离子交换柱SP柱,以最佳盐浓度洗脱液洗脱,获得纯度为91％的hBMP-4m。再上阴离子交换柱Q柱,最佳盐浓度洗脱液洗脱后,所得hBMP-4m纯度为98％。     

烟草拟核小体组装蛋白cDNA的克隆、表达及其蛋白产物的纯化

从烟草BY2细胞cDNA文库中筛选到核小体组装蛋白1(Nucleosome assembly protein1,NAP1)的cDNA，序列分析发现该NAPI的cDNA编码374个氨基酸，与巳知植物来源的NAP1同源蛋白相比具有80%，以上的同源性，而且一些具有重要功能的结构域是相当保守的，如核定位信号，核输出信号，酸性结构域及异戊烯化修饰位点，重要功能结构域的存在预示了NAP1蛋白潜在多种功能，为了深入研究MAP1的功能，应用大肠杆菌表达体系高效表达了烟草NAP1蛋白，并以表达产物进行了分离纯化。     

重组人源METTL3蛋白的表达与纯化

m6A受到甲基转移酶(METTL3,METTL14,WTAP等)/去甲基化酶(FTO,ALKBH5等)以及一些RNA 结合蛋白(YTHDF1/2/3, ELAVL1 等)的共同调控,在细胞内是一个动态可逆的过程 . 甲基化转移酶METTL3 是甲基转移酶复合物中重要的组成部分,参与调控真核生物mRNA的甲基化水平.目前关于METTL3的分子结构基础以及整个甲基化转移酶的复合物的组装机制还不是很清楚.本研究中构建了原核表达载体pET.32M.3C-METTL3 ^(1-305) ,利用大肠杆菌原核表达系统表达出了可溶性的目的蛋白,通过镍柱亲和层析,凝胶过滤层析以及离子交换层析获得了纯度高,构象均一的蛋白METTL3 ^(1-305) .除此以外,还分别利用超速离心和圆二色谱的技术对蛋白的构象以及二级结构进行了分析.已获得的高纯度融合蛋白METTL3 ^(1-305) ,为进一步研究METTL3蛋白的结构以及与复合体其他成分之间的相互作用提供了一定的基础.     

BCG 65KD热休克蛋白的纯化

目的：研究卡介苗（BCG）65KD热休克蛋白的提纯方法。方法：BCG经37℃恒温振荡培养两周,42℃热休克处理2h,培养液经离心、抽滤、盐析沉淀、SDS-PAGE分离、电泳洗脱等步聚纯化。结果：提纯产物经SDS－PAGE分析,其电泳区带在65KD位置,经抑制试验表明具有较高抗原活性结论：流程方法简单、实用,有助于对IDDM的诊断及其深入研究。     

锌指蛋白Zbed3的表达与分离纯化

将编码小鼠锌指蛋白Zbed3的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET28c,构建了含组氨酸标签的表达质粒pET28c-Zbed3,并将其转入大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RP;在20℃条件下,采用100μmol/L的异丙基硫代--βD半乳糖苷(IPTG)诱导、培养20 h而获得含Zbed3的菌体;菌体裂解液经超滤浓缩后采用镍(螯合)柱分离纯化得到锌指蛋白Zbed3(浓度达60 mg/L);同时,采用30%醋酸溶解包涵体,用0.5 mol/L的Tris-HCl(pH=8.8)缓冲液中和而使Zbed3在生理pH环境中复性.结果表明,Zbed3复性后在离心上清液中的回收率达到80%,其复性蛋白质与表达产物为可溶性(天然态)Zbed3的圆二色性光谱特征相一致,以此验证了复性后Zbed3空间构象的正确性.     

G蛋白偶联受体激酶5在大肠杆菌中的表达纯化

通过RT-PCR扩增得到了人G蛋白偶联受体激酶5(GProtein-coupledreceptorki-nase,GPK5)的基因,将其克隆到表达载体pET-28a中,并将该质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),在10μmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPIG)诱导培养下表达,通过分离纯化,得到部分纯化的GRK5蛋白。体外活性测定表明,纯化后的GPK5能够特异性地磷酸化视紫红质。动力学常数Km=4.3μmol/L,Vmax=25nmol/(mg·min),与文献报道的从真核表达系统中纯化得到的GRK5相近。